肿瘤的发生不仅是机体内细胞过度增殖的结果,也是由于不正常的细胞凋亡导致的。细胞的增殖和凋亡之间的平衡维持着机体内细胞总数的动态平衡。一旦这种自稳态被破坏就会导致疾病,尤其是癌症的发生。精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp,RGD）是构成胞外基质的各种粘连蛋白含有的一个共同的保守三肽序列,是细胞粘附和分子识别位点（Motif）。RGD三肽及其衍生物在肿瘤的治疗中起到重要作用。它不但能够竞争性的封闭肿瘤细胞上的整合蛋白,使肿瘤细胞失去对正常组织粘附的能力,从而抑制肿瘤转移,而且它还能够直接进入细胞,活化细胞凋亡途径末端的Caspase-3,从而引起结构蛋白和功能蛋白的降解,最终使细胞解体。因此含RGD的多肽或化合物有望成为治疗一些重要疾病的新制剂。本论文研究内容主要包含两个部分:一、化学法及化学法-酶法合成细胞粘附肽RGD及Bz-RGD-（OEt）₂目前,关于RGD的合成报道多为传统的化学合成方法,包括液相合成和固相合成,酶法合成RGD的报道很少。我们首次采取化学法和酶法化学法相结合的方式合成了RGD三肽和RGD前体Bz-RGD-（OEt）₂三肽,其目的是对RGD三肽的合成工艺和路线进行初步的探讨。一方面采用化学法合成RGD三肽,即先采用了一种新颖的化学法（氨解取代法）,利用化学基团之间的活性关系,通过巧妙形成的甘氨酸并制备得到产物GD二肽,再利用N-羧基内酸酐法合成了游离RGD三肽,并摸索了几种因素对肽合成的影响程度,积累了相关数据,从而为RGD三肽的规模化制备提供了理论基础和必要的技术常数。另一方面又以化学法与酶法相结合的策略合成了RGD前体Bz-RGD-（OEt）₂三肽。首先将氯乙酰化天冬氨酸氨解后得到的GD二肽,在乙醇作为溶剂体系的情况下通入干燥盐酸气体酯化,得到GD-（OEt）₂,建立了一个简便、有效、经济的合成RGD前体二肽的模型。然后用胰蛋白酶作为催化剂,以Bz-Arg-OEt为底物,Gly-Asp-（OEt）₂为亲核试剂,在水-有机溶剂双相体系中合成目标产物Bz-Arg-Gly-Asp-（OEt）₂。研究了多种因素包括体系含水量、反应时间、pH值以及底物配比等因素对RGD序列肽合成的影响。建立了最佳反应模型:30℃,pH8.0,7%Tris-HCl缓冲液,93%乙醇,反应时间7小时,三肽的最大产率为75.2%。二、含RGD的细胞粘附肽诱导HCT-8细胞的凋亡研究发现,和RGD序列相连的第4位的氨基酸对其活性影响较大,并证实了RGD-NH2的生物活性明显高于RGD。为进一步证实RGD羧基端官能团及其第四位氨基酸对其活性的影响,本文通过NCA法合成了四种含RGD的细胞粘附肽RGD、RGDS、RGD（NH₂）（2即RGE-NH₂）和RGDS-NH₂,并从以下方面研究了四种含RGD的细胞粘附肽对人大肠癌细胞（HCT-8）的生长增殖的影响。首先通过MTT试验检测细胞活力,发现RGD能够抑制细胞的生长,通过对不同浓度RGD作用于大肠癌细胞（HCT-8）不同时间后的IC50确定实验的浓度和时间,浓度为50μg/ml,时间为48小时。含RGD的细胞粘附肽RGD、RGDS和RGDS-NH2对人大肠癌细胞（HCT-8）的增殖有明显的抑制作用。于是又通过对细胞形态的观察了解到含RGD的细胞粘附肽RGD、RGDS、和RGDS-NH2之所以能够抑制HCT-8细胞的生长是由于诱导细胞发生了凋亡。为了进一步验证,我们通过流式细胞仪检测了凋亡峰,看到使大量处于增殖期的细胞阻滞于S期,不能进行增殖而表现为G0/Gl期比例增高,PI%明显下降,部分细胞发生凋亡。通过DNA电泳看到了细胞凋亡所特有的“梯状”条带。为了更进一步的研究四种含RGD的细胞粘附肽诱导凋亡的分子机制,我们通过免疫组化检测了细胞内的抗凋亡蛋白Surivivin,通过阳性率及灰度值的对比能够很清楚的看到实验组的Surivivin蛋白的表达显著的降低了,进一步证实了HCT-8细胞发生了凋亡。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）法检测Caspase-3 mRNA的表达,通过内参GAPDH和RGD、RGD-（NH₂）₂、RGDS和RGDS-NH₂作用HCT-8细胞后Caspase-3 mRNA扩增产物光密度比值,证实了含RGD的细胞粘附肽可以诱导HCT-8细胞发生凋亡。结果表明,只有含RGD序列的肽（RGD,RGDS,RGDS-NH2）才具有诱导HCT-8细胞凋亡的作用,这可能是因为细胞粘附肽对肿瘤细胞作用主要通过保守序列RGD的靶向性来起作用。RGDS和RGDS-NH2的作用明显高于RGD,但是相对于RGDS,RGDS-NH₂的活性并没有明显的提高。RGD-（NH₂）₂的实际一级结构应该是RGE-NH₂,不含RGD序列,因此不具备靶向性,也不具有诱导细胞凋亡的作用。由此证实,在介导细胞凋亡中,RGD具有高度保守的特性。