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背景:外周组织炎性损伤可以产生对初级疼痛感受器和C纤维的持续刺激,导致脊髓伤害性神经元的兴奋性增强,进而引起痛觉过敏和触诱发痛。研究证实,转录因子NFκB是促炎细胞因子、粘附分子以及血管活性介质等可诱导蛋白表达的关键物质,在炎症病理生理过程中发挥重要的作用,并且参与炎性疼痛的形成。同时,大部分通过抑制NFκB活性来抑制炎性反应的物质也显示出抗伤害性反应的效果。因而,寻找可以抑制NFκB活化的物质成为治疗炎性疼痛的方法之一。Calpain是一种钙离子依赖半胱氨酸蛋白酶,参与许多生理和病理过程。有研究显示,Calpain可以降解NFκB抑制物IκBα的PEST序列,使NFκB活化入核,启动后续靶基因的转录。这提示Calpain可能通过降解IκBα使NFκB活化,进而参与炎性疼痛的发生,而如果抑制Calpain活性则可能缓解炎性疼痛。因此,细致研究Calpain、IκBα、NFκB表达在炎性疼痛中的变化,以及它们之间的关系可以更加深入的理解炎性疼痛的发生机制,以期发现更具针对性且更有效的疼痛治疗靶点。第一部分Zymosan足底炎性疼痛模型大鼠脊髓背角Calpain活化水平的改变目的:建立Zymosan足底炎性疼痛大鼠模型,采用行为学和Western blot方法,研究zymosan足底炎性疼痛模型大鼠制模后脊髓背角Calpain活化水平的变化,以及下游IκBα、胞核NFκB的表达变化。材料与方法:Sprague-Dawley大鼠48只,随机分为3组,即正常对照组(n=8,48h行为学测定结束后处死)、假手术组(n=16,8只于制模后4h处死,8只继续行为学测量)以及zymosan组(n=24,分别于制模后4h、24h、48h处死,每个时间点处死8只)。按Meller方法通过在大鼠左侧后足皮下注射zymosan 1.25mg制作zymosan足底炎性疼痛模型,假手术组在左侧后足皮下注射同等容积的PBS。采用Von Frey压力测痛仪分别于制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h测定各组大鼠左侧后足MWT,并使用电子数显卡尺测量左足最大厚度。各组大鼠在指定时间点处死后取制模侧腰段脊髓背角,采用Western blot方法测定脊髓背角中Calpain降解底物spectrinαⅡ的表达变化以判断Calpain的活性,并测定下游IκBα和胞核NFκB表达情况。结果:1.与对照组和假手术组相比,zymosan组大鼠制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h MWT均明显降低(P＜0.05,P＜0.01),提示zymosan组大鼠出现炎性痛觉过敏。2.与对照组和假手术组相比,zymosan组大鼠制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h左足最大厚度均明显增加(P＜0.01),提示zymosan组大鼠出现炎性水肿。3.zymosan组大鼠制模后4h、24h和48h,制模侧腰段脊髓背角spectrinαⅡ降解产物表达明显增加(P＜0.01),提示脊髓背角Calpain活化水平明显增强。4.zymosan组大鼠制模后4h、24h和48h,制模侧脊髓背角IκBα表达明显下降(P＜0.01),胞核NFκB表达明显增加(P＜0.01)。结论:1.Zymosan足底炎性疼痛模型大鼠脊髓背角Calpain活化水平显著增强,可能参与炎性疼痛的形成。2.脊髓背角Calpain活化后可能通过降解IκBα,活化NFκB,参与炎性疼痛的形成。第二部分Calpain抑制剂ALLN对Zymosan足底炎性疼痛模型大鼠的镇痛作用及其对脊髓背角COX-2表达水平的影响目的:Zymosan足底炎性疼痛模型大鼠腹腔注射Calpain抑制剂ALLN,观察其镇痛作用和对脊髓背角COX-2表达的影响,进一步探讨Calpain在炎性疼痛中的作用机制。材料与方法:Sprague-Dawley大鼠64只,随机分为3组,包括假手术组(n=16)、Z+V组(n=24,分别于制模后4h、24h、48h处死,每个时间点处死8只)和Z+A组(n=24,分别于制模后4h、24h、48h处死,每个时间点处死8只)。制模方法同第一部分。Z+A组大鼠在制模前30min腹腔注射Calpain抑制剂ALLN 20mg/kg,Z+V组大鼠在制模前30min腹腔注射同体积的ALLN溶剂DMSO。通过Von Frey压力测痛仪测定各组大鼠于制模后0.5h、1h、2h、4h、8h、24h和48h的MWT,观察镇痛效果;并使用电子数显卡尺在相同时间点测量各组大鼠左足最大厚度。各组大鼠在相应时间点处死取制模侧腰段脊髓背角,采用Western blot方法测定腰段脊髓背角中COX-2的含量变化。结果:1.Z+V组大鼠疼痛仍持续存在,MWT与sham组大鼠相同时间点比较有显著差异(P＜0.05,P＜0.01)。Z+A组大鼠制模后0.5h、1h、2h、4h、48h MWT虽仍显著降低,与sham组大鼠相同时间点比较有显著差异(P＜0.05,P＜0.01);但8h和24h与sham组大鼠相同时间点比较,MWT无显著差异;且4h、8h、24h、48h与Z+V组大鼠相同时间点比较,MWT明显下降(P＜0.05),提示疼痛明显缓解。2.Z+V组大鼠制模后各时间点左足最大厚度仍显著增加,与sham组大鼠相同时间点比较有显著差异(P＜0.01)。Z+A组大鼠制模后各时间点左足最大厚度虽然仍显著增加,与sham组大鼠相同时间点比较有显著差异(P＜0.05,P＜0.01);但制模后4h、8h、24h、48h各时间点左足最大厚度与Z+V组大鼠相同时间点比较显著减小(P＜0.05),提示水肿明显缓解。3.Z+V组大鼠制模后4h、24h、48h、Z+A组大鼠制模后4h与sham组相比,脊髓背角COX-2表达水平明显增加(P＜0.01);Z+A组大鼠制模后24h和48h与sham组比较脊髓背角COX-2表达水平无显著差异;Z+A组大鼠制模后4h、24h和48h与Z+V组相同时间点比较,脊髓背角COX-2表达水平明显下降(P＜0.01)。结论:1.Calpain抑制剂ALLN可以显著缓解zymosan足底炎性疼痛模型大鼠的炎性疼痛和炎性水肿,提示Calpain抑制剂在炎性疼痛中具有治疗作用。2.Calpain抑制剂ALLN可以显著降低zymosan足底炎性疼痛模型大鼠脊髓背角COX-2的表达水平,提示Calpain活化后可能通过促进脊髓水平COX-2表达增加,参与炎性疼痛的形成。