随着社会经济的发展及生活水平的提高，特别是饮食结构的改变，2型糖尿病（Diabetes mellitus, DM）在全球的发病率呈不断上升的趋势，据统计学资料显示，我国六十岁以上老年人糖尿病患病率高达11%，预计到2030年我国将近有4.39亿人次，糖尿病患者死亡率是非糖尿病患者病死率的2倍左右，其中80%因心血管并发症而死亡。面对庞大的数据，严峻的社会健康问题及沉重的医疗卫生负担，糖尿病心肌病已引起研究学者的高度重视，关于糖尿病心肌病（Diabetic cardiomyopathy, DCM）的研究也成为众多研究的热点，具有非常重要的科学价值和临床指导意义。　　心肌纤维化（Myocardial Fibrosis, MF）是糖尿病心肌病早期、特征性的病理学改变，也是糖尿病心肌病的重要致病因素。心肌纤维化主要包括心肌肥大、凋亡及细胞外基质的沉积，最终导致心室重塑，引起心肌收缩和舒张功能失调，引起心律失常、心力衰竭、心脏长大、猝死等。越来越多的证据表明心脏重塑（Cardiac Remodeling）是糖尿病心肌病患者死亡的独立危险因素，参与心血管终末事件的发生。　　在心室重塑中，TGF-β1（transforming growth factor beta-1）由心肌成纤维细胞（myofibroblast，MFs）分泌，反作用于成纤维细胞转为为肌成纤维母细胞，分泌胶原蛋白等；同时，TGF-β1亦可由巨噬细胞产生，分泌更多的细胞粘附因子，使肌纤维母细胞的活性增加。研究表明，持续高表达TGF-β1活性加快心脏纤维化进程，在心室重塑中起到重要作用。Smads蛋白家族作为TGF-β1信号转导的重要传导蛋白，在糖尿病心肌病的细胞外基质沉积、新生血管形成及心肌肥厚中发挥的举足轻重的作用。研究证实，心肌纤维化的发生于Smad3与Smad7的表达失衡有关。在糖尿病心肌病大鼠心脏中，TGF-β1介导的信号通路可被Smad3激活，同时起正反馈作用，加速心脏重塑，而抑制型Smad7起负反馈作用，使下游相应的蛋白表达含量减少。同时，Smad7作为TGF-β1与NF-κB信号通路的重要结合点，激活的TGF-β1/smads信号通路可以诱发NF-κB、IL-1β等炎症因子和炎症介质，产生一系列的级联反应，加重心室重塑的发生、发展过程。　　Smad3作为TGF-β1信号通路传导过程中的重要信号蛋白，其表达的高低与组织纤维化程度呈正相关关系，在TGF-β1介导的组织纤维化进程中起主导作用。基于此，我们将TGF-β1/Smads与NF-κB信号通路为切入点，将Smad3作为心脏重塑的关键信号蛋白，探讨其内在机制，为糖尿病心肌病早期靶点基因干预提供科学依据。　　本研究选用C57BL/KsJ（db/db）小鼠为糖尿病心肌病动物模型，以此为评价载体，从病理学、分子生物学等多角度探讨Smad3通过TGF-β1及NF-κB信号通路介导的糖尿病心肌病纤维化及炎症的作用机制。实验共分为三部分：　　实验一：Smad3对糖尿病心肌病小鼠心脏组织形态学及心功能的影响　　以db/db小鼠作为2型糖尿病动物模型，敲除Smad3基因与否将小鼠分为5组，即S3+/+db/m，S3-/-db/m，S3+/+ db/db，S3+/-db/db， S3-/-db/db。通过观察各组小鼠的一般生活情况（精神、毛色、摄食、活动量、体重等）及空腹血糖、经腹腔注射葡萄糖（或胰岛素）后的血糖监测评估胰岛素敏感（或抵抗）等情况，且采用高分辨率显微超声进行无创心功能检测与评估。观察周期结束后，采集心脏组织行HE染色和Masson染色，分析动物模型的建立、心脏功能及组织病理结构的改变情况。　　结果：　　1.一般情况：S3+/+db/m小鼠形体适中，毛色黑润，反应灵敏；S3+/+db/db小鼠形体肥硕，毛色光泽，喜静不好动，对外界事物反应迟钝，行动极其迟缓，摄食量逐渐增加，体重亦呈上升趋势；敲除Smad3的db/db小鼠精神萎靡，形体消瘦，毛色干枯少华，摄食量明显减少，抵抗力差，易生病或死亡。　　2.空腹血糖：与S3+/+ db/m比较，S3+/+db/db、S3+/-db/db各组小鼠在各个时间检测点均有显著差异（P<0.001），S3+/+db/m小鼠血糖从4w-32w基本稳定在10mmol/L左右，而S3+/+db/db小鼠血糖最高值达到45mmol/L。与S3+/+db/db比较，S3-/-db/db组血糖明显降低，与26w达到最低值，约5mmol/L，两者比较具有显著性统计学意义（P<0.001）。? IPGTT实验与IPITT实验：两实验结果相一致，与S3+/+db/m比　　较，S3+/+db/db、S3+/-db/db的血糖曲线下面积（AUG）明显增大，具有显著性差异（P<0.001）；与S3+/+ db/db比较，S3-/-db/db AUG明显减小，具有统计学差异（P<0.01或P<0.001）。　　3.超声心动结果：与S3+/+db/m小鼠比较，S3+/+db/db、S3+/-db/db小鼠左室心肌质量明显增加（P<0.01），且S3+/+ db/db左室射血分数明显减少，约40%；与S3+/+db/db比较，S3-/-db/db左室心肌质量降低，左室有效射血分数明显增加，具有统计学意义（P<0.01或P<0.001）。　　4.病理形态学：HE染色中，S3+/+db/m小鼠可见心肌细胞排列整齐、致密，胞浆染色均匀，S3+/+db/db组心肌细胞排列紊乱，呈肥大、扭曲状，细胞间隙明显增大，敲除Smad3的小鼠心肌细胞大小不一，核染色不均一；Masson染色中，S3+/+db/m组肌原纤维分布均匀、纤细；S3+/+db/db组心肌细胞间胶原纤维排列紊乱，相互连接呈网状或团块状，S3-/-db/db组小鼠蓝绿色区域面积明显减少，相邻细胞的胶原纤维完好。　　结论：　　本课题组选用db/db小鼠模拟2型糖尿病，具有高血糖、胰岛素抵抗等特点，说明动物模型建立成功；心动超声检测结果提示模型小鼠心脏收缩与舒张功能出现障碍，存在心功能不全，说明已出现糖尿病心血管并发症，存在糖尿病心肌病，这可能与心肌间质纤维化及炎症反应有关，为下一步实验奠定基础。　　实验二：Smad3对糖尿病心肌病小鼠心脏纤维化和炎症的影响　　成功建立糖尿病心肌病小鼠模型后，分别采用免疫组化染色、RT-PCR及Western Blot等现代分子生物学手段检测心肌纤维化（Col I、III、α-SMA）及炎症（F4/80、TNF-α、IL-1β）等指标，验证敲除Smad3基因后对糖尿病心肌病心室重塑的保护作用。　　结果：　　1.纤维化指标：与S3+/+ db/m比较，S3+/+ db/db胶原纤维及α-SMA沉积明显增多，大量的粗大纤维且排列紊乱，交织成网状或片状，具有显著性差异（p﹤0.001）；与S3+/+db/db组比较，S3-/-db/db组小鼠可见棕褐色胶原纤维稀疏分布于心肌间质中，α-SMA染色明显减少，两者比较有统计学意义（p﹤0.001）。Western Blot和RT-PCR也证实与Col I、III免疫组化结果有相同趋势（p﹤0.05）。　　2.心肌炎症浸润：S3+/+db/m正常小鼠几乎无F4/80巨噬细胞浸润，而S3+/+db/db血管周围可见较多的巨噬细胞，亦引起TNF-α、IL-1β的更多表达，在敲除Smad3的db/db小鼠心脏血管周围偶可见巨噬细胞，TNF-α和IL-1β等炎症介质也明显减少，具有统计学差异（p﹤0.05）。　　结论：　　敲除Smad3可以一定程度缓解心脏纤维化和炎症进程，抑制心脏重塑，为糖尿病心肌病心室重塑的提供靶向基因治疗可能性。　　实验三：敲除Smad3改善糖尿病心肌病小鼠心室重塑的机制研究　　成功建立糖尿病心肌病小鼠模型后，基于TGF-β1与NF-κB相互交联的信号通路，采用免疫组化染色、RT-PCR及Western Blot检测TGF-β1、Smad3、Smad7、p-p65、p-IκBα等表达，同时从microRNA水平探讨Smad3调控糖尿病心肌病心室重塑的深层次作用机制，验证敲除Smad3基因后对糖尿病心肌病的保护作用。　　结果：　　1.基于TGF-β1引起的心脏纤维化　　1.1 TGF-β1介导的心脏纤维化：与S3+/+db/m比较，S3+/+db/db的TGF-β1表达量明显最多（p﹤0.001）；与S3+/+db/db比较，敲除Smad3后的db/db小鼠保持低表达TGF-β1，具有显著性差异（p﹤0.001），且Smurf2含量降低（p﹤0.05），引起高表达Smad7（p﹤0.01），从而负反馈调控下游的信号通路。　　1.2 MicroRNA21及microRNA29的表达：S3+/+db/m正常小鼠心肌组织里仅有少量的microRNA21和microRNA29表达，但在疾病病理状态下，S3+/+db/db小鼠中，microRNA21表达明显上升，S3-/-db/db有所下降（p﹤0.05或p﹤0.01）；而在敲除smad3的db/db糖尿病小鼠心肌组织中，microRNA29含量显著升高（p﹤0.01），这需进一步确认及深入研究。　　2.基于NF-κB引起的心肌炎症反应。