肿瘤的发生与发展机制一直是学者广泛关注的热点领域。通过对血液系统肿瘤、神经系统肿瘤以及乳腺癌等多种肿瘤的研究,有学者提出了干细胞样肿瘤细胞假说。该理论认为,肿瘤可能是正常干细胞在长期自我更新过程中,由于多基因突变积累导致自我更新失调而形成的无限增殖的异常组织。肿瘤组织中极少数的具有自我更新及多向分化潜能的干细胞样细胞,在肿瘤的发生、发展、耐药、复发及转移中均可能发挥至关重要的作用。肝癌是我国发病率最高的恶性肿瘤之一,因其对放、化疗不敏感,且复发和转移现象已成为肝癌治疗中的首要难题,致使肝癌预后较差,严重威胁着患者的生命。目前肝癌的发生及其进展机制尚不明确,随着对干细胞样肿瘤细胞假说的逐步论证,也有学者推测,干细胞样肿瘤细胞在肝癌的发生发展中起重要作用。MHCC97细胞系为高转移肝癌细胞株,是研究肝癌发生及转移的有利模型。目前对MHCC97细胞系中干细胞样细胞的生物学特性及其与肿瘤转移的关系等研究尚属空白。本实验利用紫外光源激发的流式细胞荧光激活分选法,分离获得MHCC97细胞系中的边缘群细胞,并进一步分析这群细胞在细胞分化能力、自我更新能力、细胞周期状态、耐药能力以及致瘤能力等方面的特性,揭示了MHCC97中边缘群细胞在肝癌发生中的重要作用。此外,本研究还首次利用上述方法对肝癌边缘群细胞和肝癌转移的关系加以研究,为阐明肝癌的转移机制奠定基础。实验一:肝癌细胞中边缘群细胞与主群细胞的分离目的:应用紫外光源激发的流式细胞荧光激活分选法分选肝癌细胞系MHCC97中边缘群和主群细胞。方法:制备Hoechst33342染色的肝癌单细胞悬液,流式细胞仪进行双荧光分析。基于干细胞样细胞具有主动外排染料的特性,将低Hoechst Red及低Hoechst Blue荧光信号且对照组缺失的鸟嘴形区域设定为边缘群细胞区域,多数细胞集中处为主群细胞区域,分选出SP细胞和MP细胞。结果:MHCC97、Huh-7和HepG2细胞系中均有边缘群细胞,占总体细胞比例分别为2.78%、0.39%和0.12%,主群细胞比例均大于50%。考虑实验的可操作性,选用MHCC97细胞进行分选,结果显示两亚群细胞分选纯度均高于97%,满足后续实验要求。原位培养的MHCC97细胞染色后显微镜下观察发现,大多数贴壁细胞的胞核与DNA染料结合呈蓝紫色。极少数细胞镜下未见核蓝染,这部分细胞即为具有主动外排Hoechst33342染料功能的边缘细胞。结论:MHCC97、Huh-7和HepG2细胞系中均含有边缘群细胞,应用紫外光源激发的流式细胞荧光激活分选法可稳定分选MHCC97中边缘群和主群细胞。实验二:肝癌细胞中边缘群细胞与主群细胞的生物学特性分析目的:研究MHCC97细胞系中边缘群和主群细胞的生物学特性,明确边缘群细胞在肝癌发生中的重要作用。方法:应用体外培养方法观察边缘群和主群细胞自我更新能力;应用Hoechst33342和Pyronin Y双染色方法测定两亚群细胞的细胞周期状态;应用实时PCR技术研究两亚群细胞中甲胎蛋白(AFP)、CK19和ABCG2/BCRP1的表达情况;通过与化疗药物共培养观察两亚群细胞的耐药性;应用免疫缺陷动物致瘤模型了解边缘群和主群细胞的致瘤能力。结果:边缘群细胞可产生边缘群和主群细胞,且边缘群细胞比例增高至(4.82±0.32)%,而主群细胞不能产生边缘群细胞。边缘群和主群细胞中处于细胞周期G0、G1和S/G2/M期的比例分别为(13.03±2.51)%, (63.90±1.95)%, (23.07±2.60)%和(0.73±0.31)%, (27.63±5.59)%, (71.63±5.62)%。边缘群细胞中AFP、CK19和ABCG2/BCRP1的表达水平为主群细胞的(1.81±0.15)倍、(1.61±0.13)倍和(1.85±0.13)倍。经多柔比星或甲氨蝶呤处理,边缘群细胞存活率为(76.6±5.6)%和(59.8±6.2)%,高于主群细胞存活率(36.8±3.6)%和(39.1±48)%。多柔比星作用3天后边缘群细胞比例上升至(5.2±0.36)%。接种1×103和1×104个边缘群细胞,5只裸鼠中分别有3只和4只成瘤。接种1×103个主群细胞无肿瘤形成,接种1×104个主群细胞,仅有1只裸鼠成瘤。病理结果提示所形成肿瘤均符合肝癌表现。结论:边缘群细胞较主群细胞,具有更强的自我更新能力及向肝细胞和胆管细胞双向分化的潜能,它们处于细胞周期中静止的G0/G1期,符合干细胞的慢周期特性,具有更强的耐药性和致瘤能力,在肝癌的发生中起到“种子细胞”的作用。实验三:肝癌细胞中边缘群细胞与主群细胞的转移相关特性分析目的:研究MHCC97细胞系中边缘群和主群细胞的转移能力。方法:选择CXCL12/CXCR4轴为切入点,应用流式细胞技术检测CXCL12作用后丝状机动蛋白F-actin的聚合水平;应用Transwell体系观察趋化因子CXCL12作用后边缘群和主群细胞趋化能力。结果:边缘群细胞在与CXCL12作用后第3、5和10分钟时,F-actin的聚合水平相对值为1.27±0.17、1.43±0.16和1.29±0.13,明显高于主群细胞相对值1.12±0.15、1.14±0.18和1.10±0.17。下室中加入CXCL12的组别中边缘群细胞其相对迁移指数为(1.56±0.10),而下室中加入CXCL12的主群细胞和下室中未加入CXCL12的边缘群细胞其相对迁移指数仅为(1.16±0.08)和(1.05±0.07)。结论:边缘群细胞对趋化因子CXCL12的反应程度高于主群细胞,具有更强的趋化性,提示边缘群细胞在肝癌的转移中可能起关键作用。综上,我们的研究从多个角度证实了MHCC97细胞中的边缘群细胞具有干细胞样特性和较强的致瘤性,在肿瘤的发生中至关重要。此外,我们也证实,MHCC97细胞系的边缘群细胞较主群细胞具有更强的化疗药物耐药性和对在肝、脑、肺、骨等肝癌转移高发部位高表达的趋化因子CXCL12的趋化性,提示这群细胞在肝癌的化疗耐药和肝内或远处转移中发挥重要作用。这一研究为揭示肝癌发生及进展机制奠定了理论基础,并将为肝癌的早期诊断、预后判断以及临床治疗提供新的思路,将为应对肝癌的耐药、转移和复发提供新的策略。