帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是全球第二大神经退行性疾病，主要病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能（dopaminergic，DA）神经元进行性丢失以及神经元中路易氏小体沉积，临床症状表现为静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳与肌肉僵直。研究认为，老化、氧化应激、神经炎症在PD病理进程中发挥重要作用，但确切发病机制尚不清楚。目前，临床最有效的治疗方案是左旋多巴（levodopa，L-DOPA）替代治疗，虽然其能迅速改善大多数PD患者的运动症状，但不能阻止黑质多巴胺能神经元退变进程，并且长期用药后易出现运动障碍等严重不良反应。因此，寻求能够缓解PD中DA神经元退变的神经保护药物迫在眉睫。近年来的研究提示，自噬（autophagy）功能异常是PD中DA神经元死亡的重要原因。细胞自噬功能障碍时， DA神经元胞内α-synuclein降解受到抑制，导致胞内α-synuclein聚集、加剧细胞损伤；另一方面胞内损伤线粒体清除的减少，造成ROS大量产生，加重氧化应激、增加细胞毒性。AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是细胞内重要的能量感受器，对自噬功能发挥重要的调节作用。当胞内ATP/AMP比例降低时，AMPK苏氨酸172（Thr172）位点发生磷酸化，活化后促进ATP生成，抑制能量消耗，维持细胞能量代谢平衡并激活自噬，减少细胞凋亡。研究发现激活或过表达AMPK减轻鱼藤酮或MPP+对DA神经元的损伤，提示调节AMPK可能成为PD治疗中新的神经保护策略。二甲双胍（metformin）是2型糖尿病主要的临床治疗药物，也是公认的AMPK激动剂，可调节细胞能量代谢，诱导自噬。二甲双胍具有调节全身代谢，抑制代谢性炎症，改善胰岛素抵抗的作用。本实验室前期研究表明全身代谢性炎症和脑内胰岛素抵抗在PD的发生发展中扮演重要作用。因此，我们推测二甲双胍具有神经保护作用，防止或减轻PD中DA神经元的退行性病变。星形胶质细胞作为脑内数量最多的细胞，不仅对DA神经元发挥营养支持功能，而且对维持脑内能量代谢平衡起重要作用。近年来的研究发现，星形胶质细胞介导的神经炎症反应也参与了神经系统疾病发生发展。靶向于神经元-胶质细胞网络功能调节成为近年PD治疗的新策略。因此，本文应用C56BL/6小鼠制备MPTP/p（1-methy-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine/probenecid）PD模型，研究二甲双胍对PD模型小鼠运动行为、中脑DA神经元、纹状体单胺类递质以及脑内神经炎症的影响。培养SH-SY5Y多巴胺能神经元细胞株，建立MPP+致细胞损伤模型，研究二甲双胍对神经元的保护机制；培养小鼠中脑原代星形胶质细胞，建立MPP+致细胞损伤模型，研究二甲双胍抑制炎症反应的机制。揭示二甲双胍的神经保护作用，为将二甲双胍发展成为理想的PD治疗药物提供实验依据。目的：研究、阐明二甲双胍对MPTP/p PD模型小鼠的神经保护作用及其机制。方法：1.应用3月龄雄性C57BL/6J小鼠，皮下注射MPTP20mg/kg，1小时后腹腔注射丙磺舒250mg/kg，一周两次，连续5周，建立MPTP/p诱导的帕金森病小鼠模型；在制备MPTP/p PD模型过程中，连续饮用5mg/ml二甲双胍水溶液5周（每天约饮用6ml）。2.最后一次MPTP/p注射后6天进行转棒行为学测试，评价小鼠运动协调能力。3.最后一次MPTP/p注射后7天摘眼球取血，利用葡萄糖氧化酶反应法测定小鼠血糖。4.应用高效液相色谱-电化学检测法（highperformance liquid chromatography-electrochemical detection, HPLC-ECD）检测小鼠纹状体单胺类递质DA、DOPAC、HVA。5.应用免疫组织化学法观察黑质中酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、α-synuclein与GFAP阳性细胞数量变化。6.应用免疫印迹法（western blotting）检测AMPK磷酸化水平、自噬蛋白LC3及p62表达、核转录因子-κB（nuclear factor-κB, NF-κB）核转位改变、炎症小体及IL-1β表达。7.应用Real-time PCR方法检测炎症因子IL-6、TNF-α、IL-4、IL-6和TGF-β mRNA的表达。8.应用MTT和LDH法检测细胞活力。9.应用H2DCF-DA荧光探针检测胞内ROS含量。10.应用流式细胞技术检测细胞线粒体膜电位。结果：1.二甲双胍减轻MPTP/p PD模型小鼠中脑DA神经元损伤及炎症反应MPTP/p PD模型小鼠血糖较正常小鼠无显著变化（P>0.05），二甲双胍（连续5周给予小鼠饮用5mg/ml二甲双胍水溶液，每天约饮用6ml）对MPTP/p PD小鼠和正常小鼠血糖均无显著影响（P>0.05）；二甲双胍治疗显著延长PD模型小鼠棒上停留时间（P <0.05），减轻MPTP/p引起的DA神经元损伤（TH+神经元数量较PD模型小鼠增加约25%，P <0.001），使纹状体DA水平升高，较PD模型小鼠增加115%（P <0.05）；二甲双胍显著抑制PD模型小鼠中脑星形胶质细胞活化、NF-κB p65亚基核转位和NLRP3炎症小体活化（P <0.05），显著减少IL-1β生成、降低TNF-α和IL-6mRNA表达（P <0.05），增高IL-10mRNA水平（P <0.05）。2.二甲双胍促进PD模型小鼠中脑自噬、减少α-synuclein沉积二甲双胍显著增强MPTP/p PD模型小鼠中脑AMPK磷酸化，诱导自噬蛋白LC3-II表达，促进自噬底物p62降解（P <0.05）；二甲双胍显著抑制MPTP/p PD模型小鼠中脑α-synuclein表达，减少α-synuclein阳性细胞数（p<0.05）。3.二甲双胍通过激活AMPK-自噬通路减轻MPP+对SH-SY5Y细胞的损伤二甲双胍（2mM）显著减轻MPP+（200μM）对SH-SY5Y细胞的损伤作用；二甲双胍显著抑制MPP+引起的SH-SY5Y细胞线粒体损伤和ROS的增加（P <0.05）。上述作用可被AMPK抑制剂Compound C（CC，10μM）和自噬抑制剂3-methyl adenine（3MA，5mM）取消（P <0.05）。4.二甲双胍通过激活AMPK-自噬通路抑制MPP+所致中脑原代星形胶质细胞的炎症反应二甲双胍显著增强星形胶质细胞AMPK磷酸化，增加LC3-II表达并降低自噬底物p62水平（P <0.05），显著抑制MPP+引起的星形胶质细胞中ROS的增加（P <0.05）；二甲双胍显著抑制MPP+诱导的星形胶质细胞IKK磷酸化、p65核转位、NLRP3炎症小体活化和IL-1β产生，降低促炎因子TNF-α和IL-6mRNA水平，显著增高抑炎因子IL-10mRNA水平（P <0.05），CC和3MA取消二甲双胍的上述作用（P <0.05）。结论：二甲双胍通过激活AMPK-自噬信号通路而对抗MPTP/MPP+所致的神经元凋亡和神经炎症作用。创新之处：1.发现二甲双胍能对抗MPTP/MPP+所致的神经元损伤，为将其发展为神经退行性疾病的治疗药物提供了实验依据。2.阐明二甲双胍通过激活AMPK-自噬信号通路、抑制代谢性炎症而发挥其神经保护作用。