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本文所用的卵巢采集自北京市顺义区鹏程食品有限公司屠宰车间,于2-3小时运送回实验室,运输温度为30-35℃。卵母细胞培养42-44小时后收集成熟卵母细胞用于孤雌激活实验。试验旨在摸索猪卵母细胞孤雌激活的电场强度和脉冲时间,并探索渗透压阶段培养法对孤雌胚胎后期发育的影响。猪卵母细胞成熟培养42-44 h后,分别在电场强度2.1 kv/mm、2.3 kv/mm、2.5 kv/mm和脉冲时间30 ms、60 ms、90 ms的9组电激活参数下进行孤雌激活试验;卵母细胞在2.1 kv/mm和30 ms的参数下进行孤雌激活后,分别培养于渗透压为271 mOsm、280 mOsm、290 mOsm、302 mOsm的PZM-3中,48 h后移入渗透压280 mOsm的PZM-3中继续培养96 h;孤雌胚胎于电激活后先在含2 mmol/L 6-DMAP的PZM-3中培养4-6 h,然后移入不含6-DMAP的PZM-3中继续培养。试验结果表明电场强度和脉冲时间两个参数间无显著的交互作用(P>0.05),三个电场强度试验组间卵裂率无显著差(P>0.05),且30 ms、60 ms、90 ms脉冲时间试验组的卵裂率呈现递减趋势,各试验组的囊胚率无显著差异(P>0.05);孤雌胚胎在渗透压为290-310 mOsm的PZM-3中培养48 h,卵裂率得到显著提高(P<0.05),渗透压对囊胚率无显著影响(P>0.05);6-DMAP对孤雌胚胎卵裂率无显著影响(P>0.05),但可以显著提高囊胚率(P<0.05)。结果提示猪卵母细胞孤雌激活需要较高的电场强度(2.1-2.3 kv/mm)而脉冲时间不宜过长(30 ms);48 h的高渗培养和6-DMAP的辅助激活有助于孤雌胚胎的后期发育。应用红色荧光基因(RFP)标记五指山猪胎儿成纤维细胞,作为猪体细胞克隆技术平台的检测信号,仅仅通过荧光激发就能识别是否是转基因猪,而不通过繁琐的分子生物学检测技术而直观检测,且在胚胎制作过程中可以实时观察制作过程的技术及方法是否可行,对于转基因猪制备有意义。本项研究采用五指山猪近交系的胎儿成纤维细胞,利用Lipofectamine? 2000脂质体转染试剂盒将RFP转化到猪胎儿成纤维细胞,细胞转化阳性率27.52%(79/287),达到本项研究的要求,两种阳性细胞克隆筛选方法均能满足下一步研究所需。试验证实本研究获得的转RFP基因的五指山猪胎儿成纤维细胞是可用的,所采用的技术路线及方法是科学的、可靠的。在RFP细胞筛选过程中,我们利用普通非转基因五指山猪胎儿成纤维细胞和转EGFP基因胎儿成纤维细胞(中科院赵建国老师慧赠)进行了体细胞克隆实验,通过融合率、卵裂率、囊胚率这几个指标对技术平台的各个环节进行逐一调整和优化,提高了单个卵巢卵母细胞的平均获得率(20-23枚),减少了显微操作时间(7-8h),由此提高了体细胞克隆的效率(卵裂率50%,囊胚率12%-15%),并同时开展了移植实验,目前已经移植四头母猪,后续实验正在进行中,移植效率有待进一步检测。