人细小病毒B19(Human Parvovirus B19, HPV B19),简称B19病毒,属于细小病毒科(Parvoviridae),红细胞病毒属(Erythrovirus),是目前为止仅有的两种能感染人类的细小病毒科成员之一。B19病毒作为一种重要病原,能感染儿童及成年人并引起一系列的疾病,感染孕妇则会导致胎儿贫血、流产及胎儿水肿。随着社会生活水平及人们疾病预防知识的提高,对于该病毒的研究已经越来越受到人们的重视。目前国内对于该病毒的研究主要局限于分子流行病学及其诊断方面,对于该病毒致病机制的分子生物学方面报道较少。本研究选择了B19病毒的非结构蛋白NS1、11kDa、7.5kDa及X蛋白为研究对象,希望通过研究B19病毒非结构蛋白对病毒启动子及细胞内因子启动子的调控作用以及非结构蛋白的出核转运机制,为揭示B19病毒非结构蛋白在病毒侵染细胞途径及其复制中的作用提供理论基础。具体研究内容包括以下两个方面：(1)人细小病毒B19非结构蛋白对p6启动子和细胞内因子启动子的调控作用B19病毒的转录由单一的p6启动子调控,通过选择性的剪切和选择性的多腺苷酸化生成12个病毒mRNA转录物。和其它细小病毒成员一样,p6启动子的活性受细胞内转录因子Spl/3,YY1,hGABP等的调控。本实验中我们通过分析预测,在p6启动子的上游存在三个ATF/CREB结合基序及一个E2F结合位点,该区域对于p6启动子活性的影响还没有相关报道。通过检测绿色荧光蛋白表达和荧光素酶活性定性并定量研究该区域对启动子活性的影响,结果显示预测的ATF/CREB结合位点能够影响p6启动子在Hela细胞内的活性,而潜在的E2F结合位点对p6启动子活性影响不大。同时,通过比较p6启动子、CMV启动子在不同非敏感细胞系中的活性,显示p6启动子在不同非敏感细胞系中均具有较高的活性,但均低于CMV启动子的活性。同时软件预测发现细小病毒科成员均存在潜在的CpG岛,而CpG岛的体外甲基化修饰能抑制p6启动子的活性。由于B19病毒NS1蛋白对p6启动子及某些细胞内基因启动子具有激活的功能,而其它非结构蛋白是否具有类似的功能还未知。我们利用荧光素酶报告检测系统发现11kDa蛋白不能反式激活p6启动子的活性；而x蛋白则如NS1蛋白一样可以上调p6启动子的活性;并且其上调启动子活性的DNA效应元件区域为其3’端78个碱基,即nt.265-343区域(含有3个潜在的ATF/CREB结合位点、1个EBS基序以及一个Spl/3结合位点),而该区域与NS1蛋白上调p6启动子活性的DNA效应元件区域一致。虽然11kDa蛋白不能上调p6启动子的活性,却能显著上调细胞内TNF-α,IL6,STAT3启动子的活性；进一步的研究发现,11kDa蛋白对IL6启动子活性的上调依赖于NF-κB信号途径,主要通过降解细胞内IκBa,诱导p65入核,进而激活IL6启动子的表达。(?)人细小病毒B19非结构蛋白定位及出核转运机制研究细小病毒成功侵染宿主细胞后,在细胞核内完成病毒基因组的复制、病毒粒子的包装。为了避免宿主细胞凋亡及宿主细胞天然免疫保护反应的影响,细小病毒在长期进化的过程中演化出一种优先机制,即在细胞衰亡之前完成核输出转运。目前大量研究发现,许多病毒的非结构蛋白通过与细胞内出核转运受体蛋白CRM1相互作用,执行自身的核质转运,进而在介导病毒RNA、蛋白质乃至病毒粒子的出核过程中起作用。由于B19病毒NS1及11kDa蛋白的缺失会降低其感染性,并且11kDa蛋白的缺失导致病毒衣壳蛋白的核集聚,因此,我们推测B19病毒非结构蛋白,尤其是11kDa蛋白可能具有介导病毒粒子出核的功能。本实验中我们主要探究了B19病毒的非结构蛋白NSl、11kDa及7.5kDa蛋白的细胞定位及其出核转运机制,发现前两者具有依赖于CRM途径的出核转运过程,同时利用哺乳动物双杂交实验证实NSl及11kDa蛋白能够与CRM1发生相互作用,通过系列的截短及定点突变确定了分别影响其出核转运的关键氨基酸位点。然而对7.5kDa蛋白的研究则发现其细胞质定位不依赖于CRM1途径,并且进一步的细胞组分及激光共聚焦显微镜观察发现,该蛋白主要定位于线粒体中；通过截短及定点突变确定了决定其亚细胞定位的关键氨基酸位点。关于B19病毒非结构蛋白的细胞定位及其出核转运机制的研究,为进一步探究B19病毒非结构蛋白在病毒复制周期尤其是病毒RNA、病毒粒子出核过程中扮演的角色奠定了基础,同时也为抗病毒药物的靶标的开发提供线索。