随着人类对石油开采的不断持续，一次性石化能源终究要枯竭，寻找替代能源成为全球关注的焦点，以燃料乙醇为主的生物能源是替代能源的一个重点。本课题研究针对发展甘蔗燃料乙醇产业的关键问题，利用基因组改组技术选育具有多重抗性的酒精酵母，并研究与之相配套的发酵工艺，提高发酵效率，缩短生产周期，有利于降低生产成本，为甘蔗燃料乙醇的生产提供理论依据和实验数据。　　 采用诱变、驯化和基因组改组技术（genome shuffling）相结合的方法，构建具有耐高温、耐高酒精、耐高渗透压、耐低pH等多重抗性的优良酵母菌株。从本实验室收集和保藏的60多株糖质原料发酵酒精酵母中，挑选24株较常用到的糖质原料发酵酒精酵母为出发菌，采用生长培养和蔗汁发酵试验分析的方法，筛选出蔗汁发酵综合发酵性状相对突出酵母菌6株，分别为：G2-24，G2-05，G2-17，G2-53，GZ-01和G2-58。通过在各种不同胁迫条件下的发酵实验，优选得到3株酵母菌：其中G2-24为耐高温酵母菌、具备较高的酒精发酵效率，G2-05为耐较高浓度酒精和渗透压，G2-58耐较低pH值。以G2-24为出发菌株，经过用紫外光诱变和温度渐进驯化相结合的方法进行定向高温驯化后。共得到7株耐42℃高温的酵母菌。其中在40℃条件下，G2-241较出发菌G2-24酒精产量提高了11％。选择G2-241作为基因组改组的耐高温正突变株。以G2-05为出发菌，经过8轮酒精浓度梯度逐渐上升的酒精处理细胞群体在含18％的酒精的培养液中培养48h存活率增加到了40．8％。筛选得到的耐酒精群体称为G2-05E。再对经过酒精冲击驯化的耐酒精群体进行三个周期高渗透压驯化实验。筛选得到酵母菌G2-0533浓醪发酵时，产酒精度达15．2％（v/v），较出发菌株G2-05的酒精产量相对提高了12．5％。G2-0533耐酒精和耐渗透压得到明显提高，作为基因组改组的耐高酒、耐高渗透压正突变株。以G2-58作为出发菌，经过化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）诱变处理，涂布于低pH筛选平板上，挑选突变子4株。经过比较4株突变株和出发菌的点滴平板生长情况，筛选出的G2-582菌株耐低pH性能较出发菌有较大的提高。　　 通过优化原生质体的制备条件为溶壁酶浓度为2 mg/mL，酶解时间均为30 min。G2-24．1的原生质体经过65℃，35 min处理，灭活率达到100％； G2-0533和G2-582的原生质体经过65℃，30min处理完全失去再生能力。G2-241和G2-0533的原生质体，经15W，30cm紫外线照射15min可以完全灭活原生质体。G2-582的原生质体，经15W，30 cm紫外线照射20 min可以达到完全灭活原生质体的效果。原生质体电穿孔融合的预排列交流电压为8V（场强400 V/cm），脉冲电压200 V（场强10 kV/cm），脉冲时间数30μ s，脉冲次数3次。　　 通过Genome shuffling技术将酵母菌株的多重耐受性能集中于同一菌株，从而选育出多重抗性的酒精酵母。以分别经过热灭活和紫外灭活的酵母GZ-0533、GZ-241、GZ-582为亲本菌株，经过3轮基因组改组（genome shuffling）后，筛选得到的28株酵母菌。第二次shuffling得到的MSR14和第三次shuffling得到的MSR23对多重胁迫条件的耐受性提高最多，酒精产量分别达到8．58％和8．86％，较多重抗性最好的出发菌GZ-05相对提高了7％和10．5％。26SrDNA序列分析表明，MSR14和MSR23的26SrDNA序列与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的同源性为100％，均认定为酿酒酵母。点滴YPD平板培养观察，MSR14和MSR23细胞菌落形态不一致，与出发菌株相比，其对外界胁迫条件的耐受性也得到一定的提高。推测酵母细胞对外界胁迫条件耐受性的变化，可能是由保守区序列以外的其他基因发生改变引起。　　 在多重抗性酵母选育的基础上，进行蔗汁酒精发酵工艺研究。研究了高酵母菌接种量的抑菌特性及对蔗汁酒精发酵过程的影响。混合杂菌与酵母以不同浓度配比接入蔗汁发酵培养基中进行发酵实验，结果表明，当增加酵母接种量达到5×107个/mL时，醪液中乙醇浓度没有明显降低。利用鲜甘蔗汁直接发酵时，接种量为5×107个/mL，乙醇产量达10．54％（v/v），与使用经高温灭菌的甘蔗汁作培养基，酵母接种量为2×107个/mL时相当，但发酵速度明显快于后者。其发酵上清液中未检出抑菌成分，说明提高酵母的接种量可以有效抑菌的原因可能是酵母的生长处于竞争优势，抑制了杂菌的生长代谢。本研究结果为蔗汁发酵生产燃料乙醇降低染菌风险提供了参考。　　 以甘蔗块为载体固定酵母细胞，通过优化载体大小和预处理方式，制备得到性能优良的固定化酵母，应用于蔗汁燃料乙醇的生产。研究结果表明，大量酵母细胞固定于甘蔗块内部空腔以及吸附于甘蔗块表面；较小的甘蔗茎块作为固定化载体，酒精产率增加10％左右；冷冻储存的甘蔗块经过解冻、去木质素处理后固定酵母，以40％的装填率发酵36h，乙醇浓度达99．34g/L，糖利用率为99．23％，发酵效率为93．09％。对该固定化酵母进行了产乙醇条件优化。在以蔗汁为发酵原料的情况下，研究了温度、初始pH、氮源、无机盐等条件对固定化酵母生产乙醇过程中的二氧化碳生成速率、酒精度、发酵效率、糖的利用率的影响。总结出发酵条件为：30℃、pH3．8、1．5 g/L酵母抽提物、0．5g/L磷酸二氢钾，酒精度最高达到12．59％，发酵效率达到94．56％，糖的利用率均在99％左右。