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目的本研究通过建立小胶质细胞(BV2细胞株)和神经元(PC12细胞株、原代神经元)两大体外模型,首先评估低浓度百草枯(PQ)对小胶质细胞的激活效应,其次探讨TLR4/NF-κB信号通路介导小胶细胞炎症反应的机制,阐明小胶质细胞激活与神经元损伤之间的关系。方法采用BV2细胞株建立体外小胶质细胞模型,PC12细胞株和原代神经元建立体外神经元模型。1.确定低浓度PQ激活BV2细胞的剂量/时间-效应关系。采用终浓度0、0.015、0.03、0.06、0.12、0.24、0.48μmol/L PQ及0.05μmol/L MPP~+处理BV2细胞24h,以及0.03μmol/L PQ处理细胞0、12、24、36、48h,CCK8法测定细胞细胞相对存活率,确定后续实验的染毒条件。2.评价低浓度PQ激活BV2细胞的有效指标。采用终浓度0、0.015、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ及0.05μmol/L MPP~+处理BV2细胞24h,酶联免疫吸附(ELISA)法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)及白介素-6(IL-6)的含量,免疫荧光法(IF)和流式细胞术测定细胞吞噬能力,Transwell小室法测定细胞迁移能力。终浓度0、0.03、0.06、0.12及0.05μmol/L MPP~+处理细胞24h,免疫印迹(Western Blot)法测定小胶质细胞M1型标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、CD86及M2型标志物Ⅰ型精氨酸酶-1(Arg-1)、甘露糖受体(CD206)的蛋白表达水平。3.探讨低浓度PQ激活TLR4/NF-κB信号通路的机制。采用终浓度0、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ、0.05μmol/L MPP~+及0.1μg/mL LPS(阳性对照)处理BV2细胞24h,Western Blot法测定信号通路中关键蛋白TLR4、MyD88、IKK、IκB-α、p-IκB-α以及全细胞、细胞质、细胞核中NF-κB的蛋白表达变化。4.探讨TLR4在PQ介导的炎症反应及BV2细胞激活中的作用。首先采用短发夹RNA(shRNA)转染BV2细胞沉默TLR4基因,构建新的细胞株Control shRNA、TLR4 shRNA BV2细胞,CCK8法测定转染对细胞存活率的影响,IF和Western Blot法分别测定沉默后TLR4蛋白表达情况。接着采用Western Blot法测定沉默前后0.06μmol/L PQ作用下信号通路中TLR4、MyD88、IKK、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB、p-NF-κB的蛋白表达变化。最后采用IF和流式细胞术测定TLR4 shRNA BV2细胞的吞噬能力,Transwell法测定迁移能力,Western Blot法测定M1/M2型细胞标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS、CD86、Arg-1、CD206的蛋白表达变化。5.探讨NF-κB在PQ介导的炎症反应中的作用。采用终浓度12.5、25、50、100、200μmol/L的NF-κB抑制剂PDTC处理BV2细胞1h,以及25μmol/L PDTC处理细胞0.5、1、1.5、2h,CCK8法测定细胞的相对存活率,确定后续实验的干预条件。接着采用Western Blot法测定干预前后0.06μmol/L PQ作用下信号通路下游NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达变化。6.探讨PQ染毒BV2细胞上清液对原代皮层神经元的损伤效应。SPF级成年C57BL/6雄性小鼠5只,雌性小鼠10只,按照雌:雄=2:1合笼,阴栓观察法及称量体重判断雌鼠是否怀孕,并在新生小鼠出生24h内提取原代皮层神经元进行培养。培养到第14天左右,采用MAP2、NeuN、β3-Tublin分别特异性标记原代神经元,IF法测定标记结果。然后,取生长良好、密度均匀的神经元,采用终浓度0、0.12、1μmol/L PQ染毒BV2细胞24h后提取细胞上清液,干预原代神经元24h,TUNEL法测定干预对原代神经元的凋亡情况。7.探讨PQ染毒BV2细胞上清液对PC12细胞的损伤效应。分别采用终浓度0、0.12、1、10μmol/L PQ染毒BV2细胞24h后提取细胞上清液,分别干预PC12细胞24、48h。采用CCK8法测定细胞的相对存活率,EDU法测定干预后PC12细胞的增殖活性,Annexin V-FITC/PI双染法测定干预后PC12细胞的凋亡率。结果1.低浓度PQ对BV2细胞增殖活性的影响:CCK8结果显示,与0μmol/L PQ比较,0.03-0.12μmol/L PQ组细胞增殖活性明显升高,0.24-0.48μmol/L PQ组细胞呈抑制状态,0.03μmol/L PQ、0.05μmol/L MPP~+处理24h细胞增殖活性明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05),因此选择0.015、0.03、0.06、0.12μmol/L PQ作用24h作为后续实验的染毒条件。2.低浓度PQ对BV2细胞活性的影响:ELISA结果显示,与0μmol/L PQ比较,染毒组细胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6含量均明显升高,尤其是0.03、0.06μmol/L PQ组,差异均有统计学意义(P<0.05);IF、流式细胞术及Transwell小室结果显示,与0μmol/L PQ比较,0.03、0.06μmol/L PQ处理组细胞吞噬能力及迁移能力均明显增强,差异均有统计学意义(P<0.05);Western Blot结果显示,与0μmol/L PQ比较,各处理组M1型细胞标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和CD86蛋白表达水平明显升高,而M2型细胞标志物Arg-1、CD206蛋白表达水平明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.低浓度PQ对BV2细胞TLR4/NF-κB信号通路的影响:与0μmol/L PQ比较,TLR4/NF-κB信号转导通路中的关键蛋白TLR4、MyD88、IKK、p-IκB-α的表达均明显升高,表现在0.06μmol/L PQ剂量组升高最为明显,差异均有统计学意义(P<0.05);在PQ染毒后,细胞全蛋白中的NF-κB表达均增高,组内无明显差异,而细胞质中的蛋白表达降低,细胞核中的蛋白表达升高,与0μmol/L PQ比较,表现在0.06μmol/L PQ剂量组达到最高峰,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.shRNA沉默TLR4基因对BV2细胞活性的影响:转染后的CCK8结果显示,与对照组比较,TLR4 shRNA组细胞存活率为86.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。IF及Western Blot结果显示,与Control shRNA组比较,TLR4 shRNA BV2细胞中的TLR4蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),由此说明细胞珠构建成功。Western Blot结果显示,与PQ染毒组比较,0.06μmol/L PQ染毒TLR4 shRNA BV2细胞后,TLR4/NF-κB信号转导通路中关键蛋白TLR4、MyD88、IKK、IκB-α、p-IκB-α、NF-κB、p-NF-κB表达均明显降低,细胞的吞噬、迁移能力均明显降低,M1型标志物TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS和CD86蛋白表达水平均明显降低,M2型标志物Arg-1、CD206蛋白表达水平均明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。5.PDTC抑制剂干预对TLR4/NF-κB信号通路的影响:CCK8结果显示,与对照组相比,50、100、200μmol/L PDTC处理BV2细胞1h,25μmol/L PDTC处理细胞1.5、2h时,BV2细胞的增殖活性均明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)。因此,选择25μmol/L PDTC作用1h来干预细胞。Western Blot法结果显示,与PQ染毒组比较,0.06μmol/L PQ染毒TLR4 shRNA BV2细胞后,信号转导通路下游的NF-κB、TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白表达均出现明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。6.PQ染毒BV2细胞上清液对原代皮层神经元的影响:神经元接种后,4h开始贴壁,胞体透亮。培养至6-7d时,神经元开始聚集,突起开始生长。当培养至12-14d时,突起增长、增多,形成很多分支,且相邻神经元之间的突起相互交织成网状;MAP2、NeuN、β3-tublin均能标记提取的原代皮层神经元,说明神经元提取成功。TUNEL结果显示,与对照组比较,随着PQ浓度的增大,BV2细胞上清液干预后神经元凋亡的数目逐渐越多。7.PQ染毒BV2细胞上清液对PC12细胞的影响:CCK8结果显示,与对照组比较,0.12、1、10μmol/L PQ染毒BV2细胞上清液干预24h后,细胞增殖活性的降低并不明显,而干预48h后,增殖活性出现明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);EDU染色结果与CCK8基本一致,表现在干预48h后,1、10μmol/L PQ染毒上清液组PC12细胞增殖活性明显被抑制;细胞凋亡结果显示,与对照组比较,干预24h后的1、10μmol/L PQ上清液组细胞的总凋亡率均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。而干预48h后,0.12、1、10μmol/L PQ上清液组总凋亡率分别为9.31%、16.25%、22.11%,与对照组相比明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论PQ能够异常激活小胶质细胞并诱导细胞表型从M1型转变为M2型,并且TLR4/NF-κB信号转导通路在小胶质细胞介导的炎症反应中扮演了十分重要的角色,同时,异常激活的小胶质细胞通过降低增殖活性、提高凋亡率来损伤神经元。