论文部分内容阅读
海马是参与调节机体能量代谢平衡的中枢，糖皮质激素(glucocorticoid,GC)以及糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)是介导此调控效应的关键因素，而且海马发育也受GC以及GR的调节，但这些研究多集中于模式动物和细胞模型。本实验室以往研究表明不同代谢类型猪血清GC基础水平存在极显著差异，但对两品种猪海马发育相关基因的表达有何影响尚不清楚，GR及其变体在海马的表达模式也不清楚。本研究的目的是比较两种不同代谢类型的新生仔猪海马发育相关基因的表达，分析GR及其变体的表达模式与GR启动子甲基化状态的关系，研究母源性甜菜碱对新生仔猪海马发育相关基因表达的影响，以及GR及其变体的表达模式，探讨母源性甜菜碱可能的表遗传作用。 1、新生仔猪海马发育相关基因表达的品种比较 以不同代谢类型猪代表品种二花脸猪与大白猪的新生仔猪为研究对象，选择新生6h以内的雄性二花脸猪和大白猪各6头（江苏省常州市永康种猪场提供）。仔猪称重记录，断头取血后，立即开颅，采集左右两侧海马，称重后迅速冻于液氮中，同时收集血清，冻存于-20℃冰箱。 新生大白猪和二花脸猪海马重量无明显差别，但二花脸猪的初生重极显著低于大白猪(P＜0.01)，二花脸猪海马体重比则极显著高于大白猪(P＜0.01)。二花脸猪血清皮质醇浓度(P＜0.01)、乳酸水平(P＜0.01)、肌酸激酶活力(P=0.077)均高于大白猪，而二花脸猪血清乳酸脱氢酶活力显著低于大白猪(P＜0.05);Real-time PCR检测海马发育相关的基因mRNA的表达，结果表明:BDNF表达二花脸猪显著高于大白猪(P＜0.05);细胞凋亡相关基因Bax的表达，二花脸猪显著低于大白猪(P＜0.05);品种间IGFs的表达量均无显著差异;自噬相关基因中，二花脸猪海马MAPlLC3A(P＜0.01)、ATG9A(P=0.06)高于大白猪。与糖皮质激素激素代谢相关的11βHSD1以及11βHSD2的表达，以及糖皮质激素的相关受体(GR、MR)表达，品种间都未表现出显著性差异;二花脸猪海马GR总蛋白表达尽管高于大白猪，但差异不显著(P=0.057)。 2、新生仔猪海马GRmRNA变体表达及GR启动子DNA甲基化的品种差异 Real-time PCR检测GRmRNA变体的结果表明，GR1-4、1-5、1-6、1-7、1-8、1-9，10、1-11在两品种猪的海马内均有表达。但品种间仅GR1-11的表达有显著差异，二花脸猪极显著高于大白猪(P＜0.01)。采用SEQUENOM Mass Array方法对GR启动子甲基化进行检测，聚类分析表明同一品种的猪，GR启动子甲基化程度相对比较一致;在位置上比较接近的点，通常都表现出了非常相似的甲基化水平，比如CPG299和CPG301.302.303，CPG72.73和CpG88。GR启动子CpG242～CpG299区间的CpG甲基化状态与GR1-11的表达明显相关;单个CpG位点的分析表明只有CPG266.267(P＜0.05)和CPG334(P＜0.05)在品种间出现显著差异，可能与GR1-11的差异表达有关。 3、母猪日粮添加甜菜碱对新生仔猪海马发育相关基因表达的影响 选择空怀二元杂交母猪12头（对照组6头，甜菜碱组6头），从配种开始直至分娩结束，对照组母猪饲喂标准日粮，试验组母猪饲喂的标准日粮中添加3000ppm的甜菜碱。每头母猪分娩时，选择体重中等且相近的两头雄性仔猪，称重记录，断头取血后，立即开颅，采集左右两侧海马，称重后迅速冻于液氮中，同时收集血清，冻存于-20℃冰箱。 试验组和对照组新生仔猪海马重量、海马重/体重也均无明显差别。血清皮质醇浓度、乳酸、乳酸脱氢酶以及肌酸激酶活力组间也无显著差异。母体添加甜菜碱后，新生仔猪海马BDNF(P＜0.01)、IGF-1R(P＜0.05)、Bcl-2(P＜0.01)mRNA表达均显著提高;自噬相关基因中，ATG9A(P＜0.05)、ATG6(P＜0.01)、MAP1LC3B(P＜0.01)的表达也显著升高。母体添加甜菜碱并没有引起新生仔猪11βHSD1、11βHSD2表达的改变，但极显著提高了GRmRNA的表达(P＜0.01)，GR变体中GR1-4显著升高(P＜0.05)，GR1-9，10极显著升高(P＜0.01);GR1-6也具有显著升高的趋势(P=0.077)，但GR总蛋白无显著性差异。DNMTs中DNMT1的表达被显著提高(P＜0.05)，DNMT3a的表达也被提高(P=0.06)。 4、母猪日粮添加甜菜碱对新生仔猪海马GR及自噬相关基因表达及表遗传修饰的影响 采用MeDIP方法分析GR以及自噬相关基因启动子DNA甲基化情况，本试验结果表明母体添加甜菜碱后，新生仔猪海马GR1-11启动子区DNA甲基化存在显著升高的区域(P＜0.05);自噬相关基因(ATG9A、ATG6、MAP1LC3B)启动子区DNA甲基化状态均下降。 鉴于GRmRNA与蛋白表达不一致，可能靶向于GR的miRNA分析表明:母体添加甜菜碱，显著提高了新生仔猪海马中miR-181a(P＜0.05)、miR-181d(P＜0.01)和miR-130b(P＜0.05)的表达。双荧光素酶报告系统体外功能验证也表明:转入miR-130b可以降低插入了GR 3UTR片段的pGL3-control质粒的荧光值。