紫杉醇是美国北卡罗莱纳州三角研究所的Wall博士和Wani博士于1967年发现,用于治疗各种癌症,如乳腺癌、肺癌、肝癌和宫颈癌等,目前是世界上最重要的抗癌药物之一。多西紫杉醇是紫杉醇衍生物,其抗癌广谱性和活性均高于紫杉醇,因此多西紫杉醇新衍生物的研究一直是国际热点。本文研究了课题组前期合成的多西紫杉醇衍生物10j抗肿瘤活性和诱导凋亡机制,为新药研发提供重要的药理基础。Smac/DIABLO蛋白存在于健康细胞的线粒体中,可以结合到IAPs蛋白的功能区域BIR上,使细胞色素C释放到细胞质中,从而激活了 caspase-3和caspase-9的功能。我们首次研究了 Smac/DIABLO和生存素之间的相互作用,它在多西紫杉醇衍生物10 j诱导肿瘤细胞凋亡过程中起到了重要作用。研究结果如下:1.应用MTT法研究多西紫杉醇衍生物10j对肿瘤细胞株生长的影响,结果多西紫杉醇衍生物10j对所试肿瘤细胞株均有不同程度的生长抑制作用,对人结肠癌细胞(HT-29),人前列腺癌细胞(PC3),人肺腺癌细胞(A549),人宫颈癌(Hela),人乳腺癌细胞(MCF-7)的 IC50分别为 118.30±1.55nM,91.38±2.94nM,117.02±1.14nM,129.59±1.87 nM和137.38±1.79 nM。其中对人前列腺癌细胞PC-3细胞的抑制作用最强。多西紫杉醇衍生物10j对正常细胞非洲绿猴肾细胞(Vero)的IC50为54.26±3.52 μM,表明其对正常的细胞毒性较小。2.采用荧光显微镜,检测经过Hochest33258染色的细胞核形态变化,未经处理的细胞核大而圆,染色均一,浅蓝色;多西紫杉醇衍生物1Oj处理PC-3细胞48 h的细胞核染色质浓集、边聚,核碎裂,并可见凋亡小体。凋亡小体是细胞凋亡的主要特征之一,说明多西紫杉醇衍生物10j可以诱导肿瘤细胞凋亡。3.采用AnnexinV-FITC/PI双染法在流式细胞仪上检测了多西紫杉醇衍生物10j诱导PC-3肿瘤细胞凋亡百分率的变化,经过多西紫杉醇衍生物10j处理PC-3细胞后,会引起肿瘤细胞凋亡,并在一定的剂量范围内,随着多西紫杉醇衍生10j药物浓度的增加,细胞凋亡百分率也逐渐提高。4.利用流式细胞仪分析了多西紫杉醇衍生物10j处理PC-3细胞后对细胞周期的影响,结果不同浓度的多西紫杉醇衍生物10j在作用PC-3细胞48h后,细胞周期发生了改变。G2/M期细胞发生大量滞留的现象,并且随着剂量的增加,这种变化愈加明显。因此,多西紫杉醇衍生物10j能诱导PC-3细胞凋亡,与引起G2/M期细胞大量积累有关。5.采用Rh123染色,应用流式细胞仪检测多西紫杉醇衍生物10j能诱导PC-3细胞线粒体膜电位(ΔΨ m)变化的影响。流式细胞仪结果显示PC-3细胞经过多西紫杉醇衍生10j作用后,随着时间延长,低荧光强度部分细胞所占百分比逐渐增加,高于对照组。说明发生ΔΨm去极化,ΔΨm降低。此结果也说明多西紫杉醇衍生物10j可能通过降低ΔΨm而引起PC-3细胞凋亡。6.多西紫杉醇衍生物 10j 可以诱导 CyclinB1,Smac/DIABLO,β-tubulin 及 Survivin 蛋白表达上调。同时,我们的结果也显示出Smac/DIABLO可以与生存素在细胞核内发生结合,能阻止有丝分裂的正常进行。多西紫杉醇衍生物10j通过下调Bcl-2蛋白的表达,上调Bax蛋白的表达,促使Cytochrome C大量从线粒体向细胞质中释放,细胞质中的 Cytochrome C 可以将 47kD 的蛋白 pro-caspase-9 激活为 37kD 的 active-caspase-9,而active-caspase-9又可以将35kD的蛋白pro-caspase-3被激活为17kD和12kD的active-caspase-3,从而完成多西紫杉醇衍生物10j诱导PC-3细胞凋亡的信号通路。综上所述,多西紫杉醇衍生物10j在不影响正常细胞生长的情况下,可以抑制肿瘤细胞增殖,这种抑制作用与诱导肿瘤细胞凋亡相关。多西紫杉醇衍生物10j通过激活线粒体凋亡途径及调节一些凋亡相关蛋白的表达诱导肿瘤细胞PC-3凋亡。以上实验结果对多西紫杉醇衍生物10j进一步的研究及开发为新药提供了良好的理论基础,具有较好的应用价值。