论文部分内容阅读
第一部分西格列汀通过影响肠道菌群及代谢物组成改善HFD小鼠糖代谢背景肠道微生物与糖尿病、肥胖等多种代谢性疾病的发生发展密切相关,通过益生元、益生菌、抗生素等方式干预肠道菌群能够调节糖代谢,重建肠道菌群可能成为糖尿病等代谢性疾病新的治疗途径。近期研究发现,二甲双胍,阿卡波糖等降糖药均可调节肠道菌群组成,但降糖药西格列汀对肠道菌群的调控及该调控是否与降糖作用有关尚不清楚,有待开展研究。目的观察西格列汀治疗前后,高脂喂养(high fat diet,HFD)小鼠肠道菌群及代谢物的组成变化,探讨降糖药西格列汀改变的肠道菌群调控糖代谢的可能机制。方法1、西格列汀处理HFD小鼠,肠道菌群及代谢物检测分析:C57BL/6雄性小鼠随机分为两组,分别为正常饮食组(normal diet,ND,n=6),高脂组(n=16)。高脂组小鼠给予高脂饲养14周,匹配体重与空腹血糖后分为高脂饮食组(HFD,n=8)和高脂饮食合并西格列汀治疗组(high fat diet mixture with sitagliptin,HFD＿Sit,n=8)。HFD组小鼠继续高脂饮食,HFD＿Sit组在高脂饲料中加入降糖药西格列汀(4g/kg)处理4周。收集各组小鼠新鲜粪便,通过16S-rDNA测序(16S-rDNA sequencing)检测ND、HFD、HFD＿Sit小鼠肠道细菌组成,采用非靶向和靶向气相色谱-质谱法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)检测HFD、HFD＿Sit小鼠肠道代谢组、短链脂肪酸(short chain fatty acids,SCFAs)水平差异。2、抗生素处理HFD小鼠:C57BL/6雄性小鼠给予高脂饮食14周,匹配体重与空腹血糖分为两组,西格列汀组(HFD mice treated by sitagliptin,Ctrl＿Sit,n=5)和抗生素合并西格列汀组(HFD mice treated by sitagliptin with antibiotics,Ab＿Sit,n=5)。Ctrl＿Sit组小鼠给予西格列汀(4g/kg)处理,Ab＿Sit组小鼠给予西格列汀(4g/kg)的同时,在饮水中加入抗生素(万古霉素0.5g/L,杆菌肽1g/L),记录小鼠体重变化。4周后比较两组HFD小鼠的空腹血糖、葡萄糖耐量等糖代谢指标。3、琥珀酸处理HFD无菌鼠:无菌(germ free,GF)鼠随机分为两组,对照组(GF mice,GF＿Ctrl,n=5)和琥珀酸处理组(GF mice treated by succinate,GF＿Succinate,n=5)。两组均给予高脂饮食,同时,琥珀酸处理组饮水中加入琥珀酸(2.5%),相当于以5%的比例加入高脂饲料中,对照组饮水中加入等量生理盐水。记录小鼠体重变化。6周后检测两组GF鼠的空腹血糖、葡萄糖耐量等糖代谢指标。结果1、16S-rDNA测序结果表明降糖药西格列汀可显著改变HFD小鼠肠道菌群组成,逆转由高脂饮食导致改变的菌属的68.6%,以增加拟杆菌为主。2、相较于单独使用西格列汀处理,合并抗生素大幅减少小鼠肠道细菌后,西格列汀的降糖效果被削减,抗生素处理组小鼠空腹血糖高于对照组(P<0.05)。3、代谢组学数据经主成分分析(principal component analysis,PCA)和热图分析发现,西格列汀处理后,HFD小鼠肠道代谢谱发生显著改变,SCFAs有增加趋势,但无统计学差异(P>0.05),琥珀酸增加了近6倍(P<0.001)。4、与对照组相比,琥珀酸处理可显著改善HFD引起的无菌鼠的糖代谢紊乱:空腹血糖降低(P<0.05),葡萄糖耐量改善(P<0.05)。结论1、西格列汀可部分逆转HFD诱导的小鼠肠道菌群结构失衡,以增加拟杆菌为主。2、对肠道菌群结构的影响,可能是西格列汀的降糖新机制。3、肠道代谢物,如琥珀酸,参与肠道菌群介导的糖代谢调控。第二部分 T2D患者缬氨酸水平及其与西格列汀降糖作用的相关性研究背景研究发现,体内高水平的支链氨基酸(branched-chain amino acids,BCAAs)和芳香族氨基酸(aromatic amino acids,AAAs)与胰岛素抵抗、2型糖尿病(type 2 diabetes,T2D)发生风险增加密切相关。在第一部分实验中,我们发现HFD小鼠经降糖药西格列汀处理后,其肠道氨基酸水平发生明显变化,这一结果提示氨基酸水平改变可能与菌群介导的糖代谢调控相关。目的分析西格列汀治疗后HFD小鼠肠道氨基酸尤其缬氨酸水平,检测健康对照、初诊T2D患者、经西格列汀治疗后的T2D患者外周血中缬氨酸水平,探讨分析外周血缬氨酸水平与T2D患者血糖水平及西格列汀降糖作用的相关性。方法1.分析西格列汀处理后,HFD小鼠肠道氨基酸水平变化。2.入组健康对照与T2D患者,分别分组为健康对照组(Control,n=19)、初诊T2D患者组(T2D,n=20)、安慰剂治疗组(T2D-Placebo,n=7)、西格列汀治疗组(T2D-Sit,n=7)。收集受试者临床资料并采集空腹静脉血,利用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测外周血中缬氨酸浓度。3.检测所有受试者糖脂代谢参数水平,包括空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)、糖化血红蛋白(hemoglobin A1c,Hb A1c)、胰岛素(insulin)、甘油三酯(triglycerides,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度胆固醇脂蛋白(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度胆固醇脂蛋白(low-density lipoprotein cholesterol,LDLC)。稳态模型评估受试者胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment for insulin resistance,HOMA-IR)和β细胞功能(homeostasis model assessment for isletβcell,HOMA-β)。结果1.西格列汀显著改变了HFD小鼠的氨基酸组成,其中缬氨酸水平显著降低(P<0.001)。2.T2D患者血浆缬氨酸水平明显高于健康对照组(P<0.05),且与空腹血糖呈显著正相关(r=0.322,P=0.046)。3.T2D患者经西格列汀治疗后,外周血缬氨酸浓度明显低于安慰剂组(P=0.034)。结论1.西格列汀显著改变HFD小鼠肠道氨基酸代谢谱,降低了缬氨酸水平。2.T2D患者血浆缬氨酸呈高水平,其浓度与空腹血糖呈正相关,西格列汀可降低T2D患者外周血缬氨酸水平。3.缬氨酸可能是T2D的潜在生物标志物,有望成为T2D的新型临床治疗靶点。