兰科植物(Orchidaceae)是仅次于菊科的一个大科,是单子叶植物中的第一大科,是真正称得上世界名花的植物,具有重大经济效益和应用前景的观赏和药用价值。但是,兰科植物受病毒病严重侵害而无法根治的问题,是阻碍兰科植物正常生长、兰科珍惜种质资源保存及兰花产业发展。对于兰科植物多年生植物来说,转基因过程中得外植体再生频率低、离体培养周期长、易受污染等问题仍然是多年生植物抗病毒株获得的瓶颈。本氏烟具有易于栽培、生长迅速、繁殖性强、离体再生频率高等特点,通常成为实验室理想的模式植物和研究材料。本研究利用植物组织培养技术,优化了大花蕙兰体外再生繁殖体系。也对感染病毒的成龄大花蕙兰叶片进行差异表达蛋白初步探讨。基于植物RNA沉默机制,对大花蕙兰和模式植物本氏烟草抗病毒基因工程初步研究,其研究成果对兰花产业具有重要应用价值和经济效益。本实验主要研究结果如下：1、利用植物组织培养技术,建立了大花蕙兰和本氏烟草的再生繁殖体系。以大花蕙兰茎尖为外植体,研究6-BA与NAA浓度梯度配比对大花蕙兰原球茎的诱导、增殖及分化的影响。结果表明,6-BA1.0mg/L+NAA0.5mg/L浓度配比下,大花蕙兰茎尖存活率达到93.3%；6-BA0.8mg/L+NAA0.4mg/L浓度配比下,原球茎诱导率达到85.8%；6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L浓度配比下,原球茎增殖系数达到4.59；6-BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L浓度配比下,原球茎出芽率达到87.5%。本研究首次报道采用6-BA0.8mg/L+NAA0.5mg/L浓度配比组合适合大花蕙兰茎尖培养,可同时获得较高的原球茎诱导率(80.8%)和出芽率(87.5%),比目前已报道的最佳原球茎诱导率(72.7%)和出芽率(76.7%)提高8%以上。2、本实验将包含CymMV和ORSV的沉默载体与选择性标记载体pCAMBIA1301直接通过基因枪法转入大花蕙兰原球茎中,在让原球茎增殖、长芽、生根,再基于植物RNA沉默机制,再用外缘的CymMV和ORSV病汁液进行侵染大花蕙兰,观察染病结果。经由实验检测,对沉默载体和标记载体的提取和鉴定,已将CymMV和ORSV的沉默载体已经转入大花蕙兰中,由于实验室污染问题,暂时没有得到转基因苗,下一步实验继续进行中3、本研究分别对健康,感染ORSV和感染CymMV+ORSV病毒的成龄大花蕙兰叶片总蛋白提取,在进行双向电泳,然后得到蛋白质点的图谱,通过分析软件分析可得出,健康、感染ORSV和CymMV+ORSV病毒大花蕙兰双向电泳图中蛋白点数分别是199个、256个、278个,健康与感染ORSV病毒的双向电泳图比较,有8个点是上调或下调,健康与感染CymMV+ORSV病毒的双向电泳图比较,有4个点是上调或下调,而感染ORSV病毒的双向电泳图中有无点有9个,感染CymMV+ORSV病毒的双向电泳图中有无点有12个,分别对以上点进行质谱差异表达分析,其研究结果将从蛋白质水平上为揭示病毒介导的寄主互作机制以及可能的病毒互作蛋白,为研究大花蕙兰与病毒互作生理生化的影响,探讨了大花蕙兰对病毒侵染响应的分子机理,为培育新型抗病品种提供了理论依据。4、本研究基于植物RNA沉默机制,通过对注射接种没有RNA酶的水的对照植株、PVX/GFP的植株、PVX/NbRBR1-GFP的植株、PVX/NbPCNAGFP的植株,观察本氏烟草植株的病毒诱导基因沉默表型,研究本氏烟草NbRBR1和NbPCNA基因的沉默对ACMV的生命周期特别是DNA复制的影响。研究结果表明内源性NbRBR1和NbPCNA基因表达的病毒诱导性基因沉默发生了,并且NbRBR1和NbPCNA的基因沉默引起了观察到的异常表型,为下一步深入研究NbRBR1和NbPCNA基因的沉默机制奠定基础。