背景随着基因测序技术在尿液微生物检测方面的应用,传统的“膀胱无菌”概念已被打破。而且,越来越多的研究表明尿液微生态在疾病的发生与发展中扮演着重要角色。T2DM患者尿糖和尿液pH值的升高,引起了尿液微生物生存环境的改变,这一改变导致患者频发尿路感染。女性患者因尿道解剖位置的特殊性,较男性更易发生尿路感染。因此,女性患者尿液微生态结构较男性可能更易发生改变。IL-8是趋化因子家族的一种细胞因子,已被用于诊断膀胱炎症。机体其它部位微生态的研究表明,微生态紊乱与局部组织炎症反应相关。所以,尿液IL-8的出现与否可能也与尿液微生态有关。众所周知,科学饮食对于T2DM患者具有延缓病情作用,这与它对肠道微生态及其免疫功能的调节作用有关。由于尿液成分主要由饮食决定,其调节效应可能也将发生于尿液微生态与膀胱炎症反应之间。如需证明此假设,首先需探讨一种适宜微生态研究的尿标本采集法。目的1.探讨一种改良式尿液微生态标本采集法(下简称“改良法”),避免导尿术采集法给患者带来的痛苦,并为尿液微生态检测的临床应用提供一项新的护理技术。2.探讨女性T2DM患者尿液微生态多样性特征,并了解患者尿液微生态是否受个体特征如血糖、尿糖和年龄等因素影响。3.探讨T2DM患者尿液微生态变化与尿液IL-8浓度的关系。4.探讨饮食对T2DM患者尿液微生态与尿液IL-8浓度相关性的调节效应。方法1.自行设计的改良法包括:①指导患者学习导尿术消毒法;②患者下蹲,自行取碘伏棉球消毒会阴部及尿道口,持续分开阴唇,排尿时依次采用4根标有1、2、3和4的50mL无菌离心管接尿。采用自身前后对照研究设计,采集了 30名拟行留置导尿术的剖宫术女性志愿者尿标本,即于术前一日采用改良法采集标本,手术当日采用导尿术采集标本。将管2和管3尿液用于微生态检测和尿培养,采用磁珠法提取细菌DNA和Miseq测序平台对细菌16S rDNA高可变区V3-V4进行测序,使用R语言和STAMP软件进行生物信息与统计分析,以比较改良法与导尿术所采集尿标本的微生态。2.应用病例对照研究设计,招募了 70名女性T2DM患者及70名健康女性作为对照组。利用改良法采集尿标本,细菌DNA的提取和测序分析方法同第一部分研究,比较T2DM患者与健康女性尿液微生态多样性特征和结构,并分析年龄、血糖、尿糖、BMI和月经等个体特征对患者微生态的影响。3.使用第二部分研究中采用改良法采集的尿标本,采用ELISA试剂盒检测尿液IL-8浓度。接下来,根据检测结果将T2DM患者分为两组:有可检测的IL-8(with detectable IL-8,WIL8)组与无可检测的 IL-8(no detectable IL-8,NIL8)组。比较WIL8与NIL8组尿液微生态是否存在组间差异。同时,将第二部分研究所探知的T2DM组与健康组有组间差异的细菌属分为某一特定细菌属的“≥ HCs”和“<HCs”亚组,继而比较两个亚组之间尿液IL-8浓度差异。另外,采用多元逐步回归分析判断与IL-8浓度变化有线性回归关系的细菌属。4.采用入户调查方式和《饮食频率法调查表》调查患者饮食摄入情况,使用Matlab软件按《食物成分表》将饮食转换为营养素。将第二部分研究中揭示的T2DM组与健康组存在组间差异的细菌属和细菌种、第三部分研究中证实的WIL8与NIL8组存在组间差异的细菌属和细菌种及与IL-8浓度具有回归关系的细菌属作为自变量,将尿液IL-8浓度作为因变量,将第二部分研究中证实的尿液微生态影响因素作为控制变量,采用分层回归分析方法进行调节效应分析。结果1.改良法与导尿术采集法的尿液标本微生态在菌群多样性特征及菌群的门、科和属水平无组间差异(p>0.05)。同时,两种采集法的标本微生态在门、科和属水平相似度均接近100%。2.女性T2DM患者尿液微生态发生了以下变化:①与健康女性相比,患者尿液微生态丰富度和多样性指数均下降(p<0.05);②微生态群落在细菌门、属和种水平发生了明显变化,主要表现在:与健康对照组相比,T2DM组细菌门绿弯菌、硝化螺旋菌和疣微菌相对丰度下降(p<0.05);33个细菌属的相对丰度在组间呈现差异(P<0.05),如普氏菌、乳杆菌和Shuttleworthia(暂无中文名,则采用英文名;根据国际惯例,细菌属和种水平采用斜体字。余同)相对丰度在T2DM组明显升高,而阿克曼氏菌、Faecalibacterium和铜绿假单胞菌相对丰度则在T2DM组降低;嗜黏蛋白阿克曼氏菌相对丰度在T2DM组明显降低;③放线菌门、卟啉单胞菌、黄杆菌目、脱硫弧菌、黄杆菌纲和柯林斯氏菌可作为T2DM生物标识物;④乳杆菌和放线菌门相对丰度随着血糖及尿糖的升高而升高,嗜黏蛋白阿克曼氏菌相对丰度则随着血糖和尿糖的升高而降低;⑤T2DM尿液微生态多样性指数Chao 1和ACE与碳水化合物及氨基酸代谢功能受损有关。3.70个标本中有46名患者的尿标本可检测出IL-8(浓度为64.31 ± 70.43 pg/mL),24名患者无可检测的IL-8。11个细菌属在WIL8组升高(p<0.05),如棒状杆菌、阿克曼氏菌和肠球菌等;10个细菌属在WIL8组下降,如Faecalibacterium、拟杆菌和铜绿假单胞菌等(p<0.05)。惰性乳杆菌在WIL8组升高(p<0.05)。T2DM组与健康组间差异细菌属中,有4个细菌属在“≥ HCs”和“<HCs”亚组的IL-8浓度有差异(p<0.05),它们是不动杆菌、克雷白氏菌、铜绿假单胞菌和细杆菌。IL-8浓度变化与18个细菌属有线性回归关系(p<0.05)。4.纤维素、VitB3和VitE摄入量对瘤胃球菌相对丰度与IL-8浓度起到正向调节效应,但饮水量为负向调节效应(p<0.05);胆固醇和镁摄入量对丛毛单胞菌相对丰度与IL-8浓度相关性起正向调节效应(p<0.05);Vit A摄入量对厌氧球菌相对丰度与IL-8浓度相关性起到负向调节效应(p<0.05)。结论1.改良法可采集到不易污染的真正中段尿。它可替代导尿术标本采集法,用于尿液微生态及尿培养标本的采集。2.女性T2DM患者尿液微生态发生了紊乱,其个体特征如血糖和尿糖值与某些关键功能菌的变化有关。同时,微生态紊乱与代谢紊乱相关。3.女性T2DM患者尿液微生态紊乱与膀胱炎症反应互为影响。4.饮食对尿液微生态与膀胱炎症反应可发挥调节效应。今后,护理人员可通过调整患者饮食方案以增加Vit A、Vit B3、Vit E与膳食纤维摄入量,以促进膀胱炎症反应的缓解。同时,护理人员宜动态监测患者水、胆固醇和镁摄入量,以防止它们的过度摄入引起的膀胱炎症反应加重。