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白细胞介素4(IL-4)主要由Th2型细胞分泌，对Th2细胞增殖、基因转录及抗凋亡起着十分重要的作用，具有多种免疫学调节功能，可与多种类型细胞相互作用从而调节宿主的防御能力及免疫应答，是机体体液免疫应答的重要调节因子。已有大量文献对哺乳类动物IL-4的生物学功能进行了研究，但在家禽中，因缺乏特异性试剂而影响了对禽类IL-4的研究，本研究旨在制备抗鸡IL-4特异性单克隆抗体(McAbs)，从而为家禽的免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节等方面的研究提供生物材料。 一.免疫原与检测抗原的制备 核酸免疫原的制备:将重组菌DH5α(pVAX1-preChIL-4)大量扩增培养后，经十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法大量提取质粒，获得pVAX1-preChIL-4质粒，浓度为15 mg/ml，纯度(A260/A280)为1.81，作为核酸免疫原。 蛋白免疫原的制备:将原核表达重组菌BL21(DE3)(pET-ChIL-4)大量扩增培养后，经IPTG诱导表达，Ni柱亲和层析纯化，获得His-ChIL-4重组蛋白。BrdU-ELISA实验表明，His-ChIL4具有促进鸡B细胞增殖的活性，且蛋白浓度为40μg/ml时活性最强。 检测抗原的制备:将原核表达重组表达菌BL21(pGEX-ChIL-4)大量扩增培养后，经IPTG诱导表达，亲和层析纯化，获得GST-ChIL-4重组蛋白，作为检测抗原。 二.抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备与鉴定 采用核酸免疫法、蛋白免疫法两种途径分别制备抗ChIL-4单克隆抗体(McAbs)。核酸免疫法:以真核表达质粒pVAX1-preChIL-4为免疫原，免疫4周龄BALB/c小鼠，每隔4周免疫一次，共免疫4次，前三次免疫采用股四头肌注射质粒与麻醉剂的混合物，加强免疫采用尾静脉注射纯化质粒，剂量均为100μg/只;蛋白免疫法:以重组蛋白His-ChIL-4为免疫原，免疫8周龄BALB/c小鼠，免疫途径采用腹部皮下多点法，首次免疫注射蛋白与弗氏完全佐剂乳化液，其余免疫注射蛋白与弗氏不完全佐剂乳化液，每隔2周免疫一次，共免疫3次，剂量均为100μg/只，三免2周后尾静脉注射His-ChIL-4作为加强免疫，50μg/只。以GST-ChIL-4为检测原，间接ELISA筛选阳性克隆，有限稀释法进行亚克隆，以获得稳定分泌抗ChIL-4 McAbs的杂交瘤细胞株。通过体内诱生腹水法制备腹水McAbs，间接ELISA、Dot-ELISA和Western-Blot法对McAbs的特异性进行测定，并应用BrdU-ELISA对McAbs抑制ChIL-4增殖活性的能力进行测定。 本课题共获得6株稳定分泌抗ChIL-4的McAbs:3E10、4D9、5B11、5C1、5D9和5E12。间接ELISA显示，6株McAbs细胞株的分泌上清效价分别为1∶800、1∶12800、1∶800、1∶800、1∶3200和1∶800;腹水效价分别为1∶1.28×104、1∶1.204×106、1∶1.28×105、1∶1.28×104、1∶2.56×105、和1∶1.28×105;亚类分别为IgG2a、IgG1、IgG1、IgG1、IgM和IgG1。Dot-ELISA结果表明，6株McAbs均只与ChIL-4特异性结合，与其他几种重组细胞因子:牛IL-4(BovIL-4)、鸡IFN-γ（ChIFN-γ）、牛IFN-γ(BovIFN-γ)和梅花鹿IFN-γ(CerIFN-γ)均无交叉反应。Western-Blot结果显示，6株McAbs均只与ChIL-4特异性结合。McAbs抑制ChIL-4增殖活性的能力测定结果表明，McAb5C1具有抑制ChIL-4增殖活性的能力。 本课题共获得了6株特异性针对ChIL-4的McAbs，为家禽的免疫检测、免疫细胞功能分析和免疫调节等方面的研究提供了条件。