论文部分内容阅读
实验目的:首先,通过整体水平的认知行为学实验和随后进行的脑组织切片免疫荧光实验探究新型GLP-1/GIP双受体激动剂DA5-CH能否有效改善阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）APP/PS1转基因小鼠的认知功能损伤和脑内典型的AD病理特征;进一步,从器官和突触水平进行在体海马晚期时相长时程增强（late-phase long-term potentiation,L-LTP）突触可塑性实验,从细胞和分子水平进行Western-blot实验,探讨DA5-CH发挥神经保护作用的细胞和分子机制,从而为AD的防治开辟新的思路和策略。实验方法:将总数为56只的9月龄APPswe/PS1dE9（APP/PS1）转基因小鼠和同窝野生型（wild type,WT）小鼠平均分成如下四组:WT+Saline组、WT+DA5-CH组、APP/PS1+Saline组和APP/PS1+DA5-CH组,每组14只,雌雄各半。在给予小鼠28天的腹腔注射DA5-CH或生理盐水后,依次进行行为学实验、在体海马L-LTP记录实验、免疫荧光实验和Western-blot实验。旷场实验、Y迷宫实验、经典Morris水迷宫实验和对位水迷宫实验属于本研究中行为学实验主要涉及项目。旷场实验中,将每只小鼠放入旷场中使其自由活动5分钟,记录其行走的总距离和在中央区停留时间的百分比。Y迷宫实验中,每只小鼠自由活动8分钟,记录其总的进臂次数和自发交替进臂顺序并计算其正确率。经典Morris水迷宫实验涉及以定位航行实验和空间探索实验为主的两个不同阶段性的实验。定位航行实验持续5天,以训练小鼠寻找位于第I象限的水下平台,用摄像头和视频分析软件记录小鼠游泳轨迹和逃避潜伏期。在空间探索实验中,将位于第I象限的平台移走,然后让小鼠自由游泳1分钟,记录其在第I象限停留时间百分比和穿越平台次数。之后是对位水迷宫实验,将平台移到对位象限即第III象限,使小鼠进行与之前相似的4天的定位航行实验和1天的空间探索实验。此外,实验还加设了可视平台下的游泳检测,其目的是为了排除运动能力和视力对之前实验的影响,将平台位于高于水面1cm的位置,并记录下小鼠到达平台的时间。在体海马L-LTP记录实验中,先将麻醉后的小鼠置于脑立体定位仪上,切皮开颅后,将平行绑定的刺激/记录一体化电极插入小鼠海马CA1区。先给予测试刺激并记录30min的基础性场兴奋性突触后电位（field excitatory postsynaptic potentials,fEPSPs）;然后给予配对脉冲刺激观察双脉冲易化（paired-pulse facilitation,PPF）;最后给予高频刺激诱导L-LTP并记录180min的fEPSPs。以上实验结束后,随机选择部分小鼠进行免疫荧光实验,将小鼠断头取出脑组织,于-80℃冰箱冰冻后,使用冰冻切片机将其切成30μm厚度的脑片,依次加入相应的一抗、二抗和DAPI,借助于激光共聚焦显微镜观察海马组织内Aβ斑块和磷酸化Tau蛋白分布情况。随机选择另一部分小鼠进行Western-blot实验,测定海马组织内p-PI3K、t-PI3K、p-AKT、t-AKT、p-GSK3β和t-GSK3β蛋白表达水平。实验结果:（1）旷场实验中,四组小鼠行走的总距离和在中央区停留时间的百分比均没有统计学差异,表明DA5-CH不影响APP/PS1和WT小鼠的运动和探索行为。（2）Y迷宫实验中,四组小鼠的总进臂次数无统计学差异。但APP/PS1+Saline组小鼠的自发交替正确率显著低于WT+Saline组（P<0.001）,给予DA5-CH治疗后APP/PS1小鼠的正确率显著提高（P<0.001）。表明:APP/PS1转基因小鼠在Y迷宫中受到严重损害的工作记忆可以被DA5-CH的治疗所改善。（3）经典Morris水迷宫定位航行实验中,APP/PS1+Saline组的逃避潜伏期明显大于WT+Saline组（第2天P<0.05,第3-5天P<0.01）,经过DA5-CH治疗的APP/PS1小鼠逃避潜伏期明显低于APP/PS1+Saline组（第3天P<0.01,第4-5天P<0.05）。这说明:APP/PS1小鼠受到损害的空间学习能力可以因DA5-CH慢性治疗而得到有效改善。空间探索实验中,APP/PS1+Saline组在第I象限游泳时间百分比和穿越平台次数明显小于WT+Saline组（分别为P<0.01和P<0.01）,而给予DA5-CH治疗后两者均有明显提高（分别是P<0.05和P<0.01）,表明AD小鼠的空间记忆损伤可以被DA5-CH慢性治疗所改善。可视平台实验中,四组小鼠到达平台的时间无统计学差异,从而排除了游泳能力和视力对之前实验的影响。（4）对位水迷宫实验中,APP/PS1模型小鼠组的平均逃避潜伏期显著高于野生对照组（第9天P<0.01,第10天P<0.05）,而DA5-CH的治疗明显减少了这一时间（第8-10天均为P<0.05）。在空间探索实验中,APP/PS1+Saline组在目标象限游泳时间百分比和穿越平台次数明显低于WT+Saline组（分别是P<0.001,P<0.05）,给予DA5-CH治疗后均得以部分恢复（分别为P<0.05和P<0.05）。这说明:DA5-CH可以保护APP/PS1小鼠的再学习能力和认知的灵活性。（5）在体海马L-LTP实验中,高频刺激后,APP/PS1小鼠在60min（P<0.05）、120min（P<0.05）和180min（P<0.05）的L-LTP维持显著低于野生型小鼠。相反,经过DA5-CH治疗的APP/PS1小鼠L-LTP得到较高水平维持（P<0.05）。这意味着AD小鼠海马L-LTP的压抑可以被DA5-CH的慢性治疗而有效逆转。此外,四组小鼠的PPF比值（fEPSP2/fEPSP1）无统计学差异,说明DA5-CH和APP/PS1转基因主要是通过突触后改变来发挥作用的。（6）在免疫荧光实验中,APP/PS1+Saline组与WT+Saline组相比,Aβ斑块和磷酸化Tau蛋白分布明显增多（P<0.001和P<0.001）。重要的是,APP/PS1+DA5-CH组与APP/PS1模型鼠相比,其海马Aβ斑块和磷酸化Tau蛋白分布显著减少（P<0.001和P<0.001）。这些结果表明:9月龄的APP/PS1转基因鼠海马内已经出现严重的Aβ斑块和神经原纤维缠结,而DA5-CH的治疗可以有效减轻这些病理特征。（7）在Western-blot实验中,各组之间总PI3K、总AKT和总GSK3β相对蛋白表达水平没有变化。然而,与WT+Saline组相比,APP/PS1+Saline组p-PI3K（P<0.05）、p-AKT（P<0.05）水平下调,p-GSK3β水平上调（P<0.05）。给予DA5-CH治疗后的APP/PS1小鼠与APP/PS1+Saline组相比,p-PI3K（P<0.05）、p-AKT（P<0.05）水平增加,p-GSK3β水平下降（P<0.05）。这表明:DA5-CH可能通过改善PI3K/AKT/GSK3β信号通路实现其对APP/PS1小鼠的行为学和病理特征保护作用。结论:本研究首次证明,新型GLP-1/GIP双受体激动剂DA5-CH对阿尔茨海默病APP/PS1转基因小鼠认知行为和病理改变具有神经保护作用。DA5-CH的这种神经保护作用与海马突触可塑性的提高以及海马组织内PI3K/AKT/GSK3β信号通路的改善密切相关。因此,本研究为AD等神经退行性疾病的治疗提供了新的有效靶点。