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为了解决番茄灰霉病问题,采集淄博市感染灰霉病的大棚蔬菜土壤样品,采用稀释分离法分离到6株拮抗细菌菌株B-01、B-02、B-03、B-04、B-06、B-07。拮抗试验结果表明6个菌株均具有很强的抗灰霉病菌活性。根据抑菌圈大小,B-02、B-04、B-06抗性比较强,抑菌圈半径>14.0mm,其中拮抗作用最强的B-06菌株,抑菌圈半径达20.1mm。对其进行形态特征观察、生理生化特性测定以及16S rDNA序列分析,结果显示6株细菌均为直的杆状,有鞭毛能运动,能生成抗热的芽孢,芽孢椭圆形,革兰氏染色均为阳性。对16S rDN序列进行测定和同源性比对,依据《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》第九版芽孢杆菌属内特征,结合生理生化反应特性确定B-01,B-02,B-03,B-04为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus),B-06为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),B-07为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)。为了进一步确定其抑菌作用,对滤液抑菌活性进行测定,发现B-02、B-06滤液对灰霉病原菌均有很强的抑制作用,培养皿上在滴有对照液的一侧,菌丝向前伸展,菌丝形态表现正常。而滴有滤液的一侧,菌丝生长速度远低于对照侧,菌丝形态发生畸变,不能正常向四周生长,菌落边缘不整齐,变异部分菌落颜色变深。滤液在稀释不同倍数时均能抑制灰霉病菌的萌发,使其不能进一步发育成菌丝体,失去侵染能力,但随着稀释倍数的增加,抑菌率显著降低。其余四株无明显的抑菌作用。β-1,3-葡聚糖酶能降解植物病原真菌细胞壁β-1,3-葡聚糖多聚体,从而抑制真菌的生长及增殖。因此本实验将β-1,3-葡聚糖酶基因转化到拮抗菌中,以增强其防病效果。用两种限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切质粒pUC1940,酶切可得到两种DNA片断,其一为4.1kb,其二为2.7kb,经0.8%琼脂糖凝胶电泳,回收4.1kb的片断(含有启动子的β-1,3-葡聚糖酶基因);同样用限制性内切酶EcoRⅠ和SalⅠ双酶切大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBE2和pHY300PLK,将4.1kb的片断与质粒pBE2和pHY300PLK连接,获得重组质粒pBE2-glu和pHY300PLK-glu,电击转化6株芽孢杆菌,只有B-04转化成功,在1400V、50uF、200Ω、2mm获得最大转化个数。将工程菌株命名为B-04-glu,与野生菌株相比,B-04-glu在ABP平板上可以看到透明的水解圈,表明转入β-1,3-葡聚糖酶基因后的B-04菌株可以正常表达;生长曲线与野生型没有明显的差异,表明增加β-1,3-葡聚糖酶基因并没有影响到B-04菌株的正常生长;质粒稳定性测定显示两种质粒遗传稳定性均为90%以上;平板拮抗试验表明工程菌株对番茄灰霉病菌抑菌效果明显增强。