目的:口腔癌在恶性肿瘤的发病中居第六位,约占全身恶性肿瘤的3%,其恶性程度较高,五年存活率不足50%,严重威胁人类健康。口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最常见的口腔恶性肿瘤,占90%以上。绝大多数口腔鳞状细胞癌都具有明确的癌前损害阶段,因此研究病变的不同阶段、临床变化、控制以及治疗oscc有着重要的意义。研究发现细胞角蛋白19(cytokeratin,CK19)在口腔颌面部的多种病变中均有表达,它是构成细胞骨架的一种酸性多肽,分子量为40×103Da,为上皮细胞特征性的一种标志物,其表达不会随细胞的癌变而丧失。CK19为Ⅰ型角蛋白,主要表达于单层上皮或快速分裂的上皮细胞中,也散在表达于复层鳞状上皮的基底层细胞。之前的研究多局限于检测人不同分化程度口腔鳞癌组织中CK19的表达变化,以及探讨口腔鳞癌患者血清中CK19的含量,但缺乏在癌变大鼠外周血的动态研究。查阅国内外资料发现该蛋白能否作为早期诊断口腔鳞状细胞癌的指标还未进行深入研究,也未得出一致结论。E-钙粘素(E-Cadherin,E-cad)是一类钙依赖性跨膜蛋白,主要介导同种细胞间的粘附反应。钙粘素分子具有共同的结构部分,其结构包括细胞外区、跨膜区、细胞内区。目前,国内外学者的研究均表明E-钙粘素在癌变组织中表达减少,但对癌变形成前期由轻度上皮异常增生到中度上皮异常增生再到重度上皮异常增生的整个癌前病变阶段中E-钙粘素是否存在连续性变化尚未有全面的报道。本研究拟取得大鼠舌粘膜癌变发生和发展阶段外周血中CK19和E-钙粘素含量的数据,对其在口腔黏膜癌变过程中外周血中的变化进行研究。探讨大鼠舌黏膜癌变的外周血中CK19与E-cad的变化趋势和各组间的差异是否具有显著性以及不同病变阶段是否存在相关性,为癌前诊断和癌症的治疗提供有力证据。方法:在屏障系统中,采用含有质量分数为0.004%的4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinoline-l-oxide,4NQO)饮水饲养实验组75只无特定病原体(specific pathogen free,SPF)SD大鼠以诱发舌黏膜癌变全过程,建立舌鳞状细胞癌动物模型。15只正常饮水的SPF级SD大鼠作为阴性对照。分别于饲养后第10、14、18、22、24周分为5批次处死实验组大鼠,并于24周处死对照组大鼠,即刻进行口腔舌黏膜组织取材,部分新鲜组织用甲醛固定、包埋、切片、苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后确定病变性质并做病理分级,对应的剩余新鲜舌黏膜组织置于-80℃保存备用。同时取大鼠外周血,低温离心后取上层血清液体作为实验对象。按照病例分级将所对应编号的血清样本分为对照组,上皮单纯增生组,轻度上皮异常增生组,中、重度上皮异常增生组,舌鳞状细胞癌组。采用ELISA的实验方法进行检验,购买上海研域生物科技有限公司抗大鼠CK19试剂盒和E-cad试剂盒,抗大鼠CK19试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠角蛋白。用纯化的大鼠角蛋白,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次角蛋白,再与HRP标记的角蛋白,Ⅰ型细胞骨架19(krt19)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TBM显色。颜色的深浅和样品中的角蛋白19(krt19)呈正相关。E-cad试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA),已知E-cad浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算待测样品浓度,从而得出实验所需数据。结果:实验组大鼠之间斗殴死亡1只,麻醉意外死亡1只,癌发后身体衰竭死亡6只,共获有效实验对象82只。82只有效实验大鼠中:舌正常粘膜25.6%(21/82)、上皮单纯增生25.6%(21/82)、轻度上皮异常增生17.1%(14/82)、中度上皮异常增生9.8%(8/82)、重度上皮异常增生2.4%(2/82)、舌鳞状细胞癌19.5%(16/82)。实验组病理分级结果采用等级资料的多个独立样本的Kruskal-Wallis秩和检验,舌粘膜χ2=20.738,P<0.005。结果分布存在差异,有统计学意义。在4NQO饮水诱导SPF级SD大鼠舌粘膜癌变过程中,CK19、E-cad在大鼠外周血中随着上皮异常程度的增加其含量均随之增加。CK19在对照组、上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中-重度上皮异常增生组和舌鳞状细胞癌组的浓度均值浓度分别为:593.45、784.45、848.58、951.94、1004.22。对各组间的差异进行比较,P<0.01,按照α=0.05,对照组和上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中-重度上皮异常增生组、舌鳞状细胞癌组差异均有统计学意义;上皮单纯增生组和轻度上皮异常增生组P=0.113,按照α=0.05差异无统计学意义;轻度上皮异常增生组和中-重度上皮异常增生组P=0.310,按照α=0.05差异无统计学意义;舌鳞状细胞癌组和其余各组均P<0.05,按照α=0.05差异有统计学意义,舌鳞状细胞癌组和对照组和上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中-重度上皮异常增生组差异均有统计学意义。E-cad在正常组、上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中-重度上皮异常增生组和舌鳞状细胞癌组的浓度均值分别为:259.92、402.85、412.39、466.25、539.14。在各组间的差异性比较中,对照组和其余各组均P<0.01,按照α=0.05,对照组和上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中-重度上皮异常增生组、舌鳞状细胞癌组差异均有统计学意义;单纯上皮增生组和轻度上皮异常增生组P=0.756,按照α=0.05差异无统计学意义;单纯上皮增生组和中重度上皮异常增生组之间P=0.066,按照α=0.05差异无统计学意义;轻度上皮异常增生组和中-重度上皮异常增生组之间P=0.146,按照α=0.05差异无统计学意义;舌鳞状细胞癌组和其余各组间均P<0.01,按照α=0.05,对照组和上皮单纯增生组、轻度上皮异常增生组、中-重度上皮异常增生组、舌鳞状细胞癌组差异均有统计学意义。对CK19和E-cad在大鼠舌黏膜癌变各阶段组织表达的相关性进行分析,CK19和E-cad呈正相关,即CK19值随Ecad值的增加而增加,CK19每增加1(ng/L),Ecad值的估计平均值会增加0.738(ng/L)。结论:(1)在4NQO饮水诱导SPF级SD大鼠舌粘膜癌变过程中,外周血中CK19的含量随病变程度加重而显著增加。(2)在4NQO饮水诱导SPF级SD大鼠舌粘膜癌变过程中,外周血中E-cad的含量随病变程度加重而显著增加。(3)在4NQO饮水诱导SPF级SD大鼠舌粘膜癌变过程中,外周血中CK19、E-cad的含量增加呈正相关。(4)在4NQO饮水诱导SPF级SD大鼠舌粘膜癌变过程中,外周血中CK19、E-cad的含量可以作为预测病变程度的标志。