论文部分内容阅读
(R)-3-奎宁醇结构是多种新型药物的重要手性中间体,包括长期维持治疗慢性阻塞性肺病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD)的新型抗胆碱能药物阿地溴铵(Aclidinium bromide)、瑞伐托酯(Revatropate),治疗膀胱过度活动综合症(Overactive Bladder,OAB)的索利那新(Solifenacin)和治疗阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)的他沙利定(Talsaclidine)等药物。无论是化学方法,如化学拆分法、化学不对称合成法、手性色谱分离法,还是生物方法,如酶法拆分、生物合成与生物拆分法等,最终产物(R)-3-奎宁醇的对映体值都不高。因此,本课题拟借助基因重组技术、蛋白质工程、透性化技术和酶的固定化技术,建立生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇的高效率绿色化方法。具体研究内容如下:1.工程菌的构建。根据奎宁酮还原酶(Quinuclidinone Reductases,QNR)和葡萄糖脱氢酶(Glucose Dehydrogenase,GDH)在Genbank中核苷酸序列,合成获得目的基因片段,通过双酶切与载体pET-28α相连,构建pET28α-QNR和pET28α-GDH两种质粒。质粒转化大肠杆菌DH5α和E.coli BL21,分别用于质粒抽提和酶表达。2.酶表达及条件优化。为获得高表达可溶性的目标蛋白,优化培养温度、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropy-β-D-Thiogalactoside,IPTG)浓度、诱导时间等表达条件。根据表达量高低和催化活性大小,经SDS-PAGE(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)分析获得最佳培养条件:温度为25℃,IPTG的终浓度为0.8 mM,诱导时间为72 h。3.原位纯化和固定化酶。基于固定化金属离子亲和层析(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography,IMAC)法实现酶的原位纯化和固定化。纯化后,QNR的浓度为0.557 mg/mL,酶活力为4.2U/mL。GDH的浓度为0.600 mg/mL,酶活力为10.8 U/mL。4.生物催化不对称合成(R)-3-奎宁醇。分别用全细胞、透性化细胞和固定化酶方法合成(R)-3-奎宁醇。用全细胞作催化剂,优化温度、pH值、催化剂/底物比等合成条件。最适反应温度为25-30℃;p H 7.0-8.0;全细胞与最大底物量比例为1:13;气相测定转化率为100%;发酵体积50 g/L。用透性化细胞作催化剂。用甲苯作透性剂,加入量为反应液总体积的0.4%,其余条件和全细胞相同,发现催化时间可以缩短0.5-1 h。用固定化酶作催化剂,当底物量与固定化酶比例为9:1时,转化时间3 h,转化率100%;11:1时,转化时间4 h,转化率100%;13:1时,转化时间5 h,转化率100%;比例大于14:1时,不能完全转化。固定化酶作催化剂完成循环反应时,随着固定化酶的循环使用次数增加,反应时间随之延长,固定化酶活性降低。底物量为固定化酶5.5倍时可循环5次,转化率100%,3.6倍时可循环7次,转化率100%,最终可循环的最大次数为8次。5.(R)-3-奎宁醇的分离纯化。用三氯乙酸除去蛋白质,过滤得到澄清滤液,用5M NaOH调节pH≥12,浓缩得白色固体。用甲苯作溶剂溶解,趁热过滤除去难溶物,滤液冷却、结晶得到白色针状结晶,收率76%。6.(R)-3-奎宁醇的结构确证。m p:217-224℃。通过1H-NMR和MR结构分析,产物为3-奎宁醇;GC分析产物构型为(R)-3-奎宁醇,ee值100%。通过实验发现:无论是用全细胞、透性化细胞,还是用固定化酶作生物催化剂,催化不对称还原3-奎宁酮,都能获得高产率、高转化率、高光学活性的(R)-3-奎宁醇。革除了有机溶剂的大量使用,为绿色并产业化合成(R)-3-奎宁醇提供了理论和技术支撑。