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第一部分 乳腺肿瘤患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子的表达及与TFH、TFR细胞亚群的相关性目的:浸润性乳腺癌患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子与TFH、TFR细胞亚群的相关性还不明确,通过研究OX40、PD-1、CXCR5分子的表达并分析其与TFH、TFR细胞亚群的相关性,明确浸润性乳腺癌患者外周血OX40、PD-1、CXCR5分子的表达和TFH、TFR细胞亚群的分布情况及与临床病理特征的相关性。方法:采用免疫组织化学方法、流式细胞仪检测肿瘤局部组织以及乳腺肿瘤患者外周血中OX40、PD-1、CXCR5分子的表达及其与TFH、TFR细胞亚群的相关性,并分析这些分子及细胞亚群与临床病理参数之间的相关性;利用全基因测序技术分析OX40信号激发与TFH细胞相关基因的表达情况;利用TRAF6敲基因小鼠分析OX40信号阻断后,TFH细胞相关分子及细胞因子的表达情况。结果:(1)浸润性乳腺癌肿瘤局部组织PD-1分子与CD4+T细胞密度显著高于原位癌及纤维腺瘤,其差异有明显统计学意义(P=0.001,z=-5.548;P=0.001,z=-4.418);(2)随着肿瘤组织学分级的升高以及临床分期的增加,肿瘤周围浸润淋巴细胞中PD-1蛋白阳性表达也随之升高,其差异有显著统计学意义(P=0.009,z=-2.792;P=0.017,z=-1.151);且浸润性乳腺癌肿瘤局部浸润淋巴细胞PD-1蛋白阳性表达与CD4+T细胞存在共表达(P=0.014,kappa=0.19);(3)浸润性乳腺癌患者外周血检测结果显示随着TNM临床分期的升高,PD-1+CD4+T细胞、TFH细胞的百分率也随之上升(P=0.03,P=0.01);同时,随着肿瘤直径的增大,外周血中TFH、TFR细胞的百分率也明显升高,差距具有显著统计学意义(P=0.01,P=0.03);(4)随着TNM临床分期的升高和肿瘤直径的增加,浸润性乳腺癌患者外周血中TFH细胞其表面OX40分子的表达呈下降趋势,但未见明显统计学差异(P>0.05);(5)相关性分析结果显示,浸润性乳腺癌患者外周血中CXCR5与TFH细胞(r=0.37,P<0.01)、OX40与 TFH 细胞(r=0.26,P=0.01)、PD-1 与 TFH 细胞(r=0.55,P<0.01)、CXCR5 与TFR细胞(r=0.42,P<0.01)、PD-1与TFR细胞(r=0.48,P<0.01)均存在显著正相关性。(6)全基因测序结果显示,OX40信号的激发可上调小鼠CXCR5、IL-21、IL-9、Tnfrsf4等相关基因的表达;(7)OX40信号激发下,相对野生型,TRAF6基因敲除后,小鼠TFH细胞的百分率以及细胞因子IL-21的分泌显著下降(P=0.001;P=0.001)。结论:肿瘤局部浸润淋巴细胞以及外周血CD4+T细胞上PD-1分子的表达、TFH细胞的百分率均与乳腺癌患者临床分期密切相关,且OX40信号的激发可影响TFH细胞表面分子的表达以及细胞因子IL-21的分泌。第二部分 乳腺癌外周血中TFH细胞和TFR细胞与B细胞亚群的相关性及其生物学意义目的:浸润性乳腺癌患者外周血中TFH、TFR与B细胞亚群的相关性及其生物学意义尚不明确,通过研究B细胞亚群及TFH、TFR细胞亚群和细胞表面OX40的分布,了解TFH、TFR与B细胞亚群的相关性及其生物学意义。方法:采用流式细胞仪检测乳腺肿瘤患者外周血中成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、浆母细胞及长寿命浆细胞与TFH、TFR细胞亚群的相关性,并分析这些细胞亚群与临床病理参数之间的相关性。结果:(1)浸润性乳腺癌患者外周血中成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、浆母细胞、长寿命浆细胞显著高于健康人,其差异具有统计学意义(P<0.05);(2)在临床Ⅰ期和Ⅳ期、ER阴性、PR阴性以及三阴性乳腺癌中,患者外周血中成熟B细胞百分率明显增加并具有显著统计学意义(P=0.008;P<0.001;P<0.001;P<0.001);(3)随着TNM分期增加,记忆性B细胞的数量呈下降趋势;经统计学分析,差异具有统计学意义(P=0.010);在HER2亚型和TNBC组中有较高记忆性B细胞(P=0.006),且记忆性B细胞与HER2阳性表达存在显著的相关性(P=0.007);(4)浆母细胞与淋巴结转移具有显著统计学意义(P=0.001);(5)长寿命浆细胞的百分率在TNM分期的Ⅱ期和Ⅳ期明显低于Ⅰ期和Ⅲ期,差距具有统计学意义(P=0.025);(6)相关性分析结果显示,记忆性B细胞与成熟B细胞(r=0.58,P<0.01)、浆细胞(r=0.41,P<0.01)、浆母细胞(r=0.40,P<0.01)、长寿命浆细胞(r=0.81,P<0.01)均成正相关;成熟B细胞与浆母细胞(r=0.43,P<0.01)、长寿命浆细胞(r=0.69,P<0.01)、浆细胞(r=0.46,P<0.01)均成正相关;长寿命浆细胞与浆母细胞(r=0.65,P<0.01)、浆细胞与浆母细胞(r=0.78,P<0.01)、浆细胞与长寿命浆细胞成(r=0.66,P<0.01,)均成正相关;(7)OX40+TFH细胞分别与浆母细胞(r=0.26,P=0.03)、长寿命浆细胞(r=0.32,P=0.01)、浆细胞(r=0.26,P=0.04)成正相关。结论:浸润性乳腺癌患者外周血中存在一定数量的成熟B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、浆母细胞以及长寿命浆细胞且彼此成正相关,且TFH细胞表面OX40分子与浆细胞的活化过程存在相关性。这提示体液免疫也是浸润性乳腺癌肿瘤免疫中一种形式,且与肿瘤临床分期、分子分型密切相关。第三部分 乳腺癌外周血中B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义目的:浸润性乳腺癌患者外周血中B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义尚不明确,通过检测CD4+T细胞与CD19+B细胞及各自亚群的分布情况及相关性,观察其表面CD24、CD38和PD-L1分子的表达,并分析这些细胞亚群与临床病理参数之间的相关性,了解B细胞亚群对T细胞亚群的调控及其生物学意义。方法:采用流式细胞仪检测乳腺肿瘤患者外周血中CD4+T细胞与CD19+B细胞及各自亚群的分布情况及相关性,观察其表面CD24、CD38和PD-L1分子的表达,并分析这些细胞亚群与临床病理参数之间的相关性。结果:(1)浸润性乳腺癌患者外周血中CD4+CD25+CD127low/-Tregs细胞显著高于纤维腺瘤患者和健康人,其差异具有统计学意义(P<0.05);且CD4+CD25+CD127low/-Tregs低表达PD-1分子,而CD4+CD25+CD127+效应性T细胞则高表达PD-1分子(P<0.05);(2)浸润性乳腺癌患者外周血中CD19+CD24+CD38+Bregs的百分率显著高于良性患者和健康人(P<0.05),且分泌高水平的IL-10(P=0.046);(3)浸润性乳腺癌患者外周血中,相对于non-Bregs,无论是PD-L1lo还是PD-L1hi都高表达于 CD19+CD24+CD38+Bregs(P<0.001),且随着 TNM 分期升高,CD19+CD24+CD38+PD-L1+Bregs的百分率也随之升高(P=0.011);(4)通过浸润性乳腺癌患者外周血中各细胞亚群的相关性进行分析发现,CD4+T细胞和CD19+B细胞(r=0.397,P<0.001)、CD4+CD25+CD127low/-Tregs 和 CD19+CD24+CD38+Bregs(r=0.316,P=0.001)、PD-L1+Bregs 和 CD19+CD24+CD38+Bregs(r=0.267,P=0.007)、PD-L1+Bregs 和 CD4+CD25+CD127low/-Tregs(r=0.299,P=0.003)均存在正相关;而 PD-L1+Bregs 与 PD-1hi CD4+CD25+CD127+效应 T 细胞则存在着负相关(r=-0.22,P=0.031)。结论:浸润性乳腺癌患者外周血中存在高水平CD4+CD25+CD127low/-Tregs和分泌 IL-10 的 CD19+CD24+CD38+Bregs,其中 CD19+CD24+CD38+Bregs 高表达 PD-L1分子并与CD4+CD25+CD127low/-Tregs呈正相关,与PD-1hi效应性T细胞呈负相关,提示PD-1/PD-L1信号可能介导效应性T细胞的凋亡。