论文部分内容阅读
研究目的本研究利用永久性大脑中动脉闭塞大鼠模型（pMCAO）,探讨不同时间窗内泵入不同剂量尤瑞克林（Urinary Kallindinogenase,HUK）对pMCAO模型大鼠的神经保护作用及其作用机制。研究方法（1）SD大鼠120只随机分为假手术组、pMCAO组、NaCl组（pMCAO+生理盐水注射组）和HUK组。根据不同剂量和时间窗,HUK组又分为9组:低剂量0.5 h组(建模后0.5 h泵入7.8125×10-4 PNAU/Kg HUK)、低剂量1.5 h组(建模后1.5 h泵入7.8125×10-4 PNAU/Kg HUK)、低剂量3 h组(建模后3 h泵入7.8125×10-4PNAU/Kg HUK),中剂量0.5 h组(建模后0.5 h泵入15.625×10-4 PNAU/Kg HUK)、中剂量1.5 h组(建模后1.5 h泵入15.625×10-4 PNAU/Kg HUK)、中剂量3 h组(建模后3 h泵入15.625×10-4 PNAU/Kg HUK),高剂量0.5 h组(建模后0.5 h泵入31.25×10-4 PNAU/Kg HUK)、高剂量1.5 h组(建模后1.5 h泵入31.25×10-4 PNAU/Kg HUK)、高剂量3 h组(建模后3 h泵入31.25×10-4 PNAU/Kg HUK)。在大鼠大脑中动脉闭塞24 h后,通过测定神经功能缺损评分、脑梗死面积大小、ELISA检测脑脊液中缓激肽和血管内皮生长因子的含量,探讨尤瑞克林对大脑中动脉闭塞大鼠的神经保护作用。（2）利用pMCAO模型动脉泵入最佳剂量HUK作为治疗组,动脉泵入生理盐水作为阴性对照组,侧脑室给药PI3K抑制剂LY294002溶液观察阻断PI3K通路后HUK的治疗效果。给药后7天,通过比较不同组别大鼠的神经功能缺损评分、海马区病理变化、脑梗死面积、脑损伤标志物的表达、炎症相关因子和细胞凋亡及相关蛋白的表达,探讨动脉泵入HUK对大脑中动脉闭塞大鼠的神经保护作用;通过比较不同实验组的大鼠脑组织PI3K、AKT和FoxO1磷酸化及非磷酸化蛋白的表达,研究PI3K/AKT/FoxO1信号通路通过动脉泵入HUK对大鼠的神经功能保护作用及其机制。研究结果1.神经功能缺损评分结果显示,除假手术组外,HUK中剂量0.5 h组评分最低（1.21±0.04）,与pMCAO组（4.60±0.07）相比差异显著（P<0.05）。HUK低剂量0.5 h组和HUK高剂量0.5 h组虽在各自的剂量组别中效果较好（分别为3.11±0.05和1.59±0.11）,与HUK中剂量0.5 h组相比差异显著（P<0.05）。2.梗死体积计算结果显示,各剂量组中均在pMCAO后0.5 h泵入HUK疗效最好,其中HUK中剂量0.5 h组的梗死体积占对侧总体积的百分比为6.05±0.68%,治疗效果在HUK治疗各组中最为显著,与pMCAO组（38.69±4.06%）相比差异显著（P<0.05）。HUK低剂量0.5 h组和HUK高剂量0.5 h组的梗死体积占对侧总体积的百分比分别为26.29±1.89%和17.79±1.50%,与HUK中剂量0.5 h组相比差异显著（P<0.05）。3.ELISA检测脑脊液中BK和VEGF含量的趋势与前两项实验结果一致,均是HUK中剂量0.5 h组最接近假手术组,BK和VEGF含量分别为61.05±2.40 pg/ml和98.79±5.79 pg/ml,与pMCAO组的BK和VEGF含量（102.6±3.99 pg/ml和215.64±9.71 pg/ml）相比明显降低（P<0.05）。在其他不同剂量和时间点的各组中,HUK中剂量1.5 h组和HUK高剂量0.5 h组的效果优于其他各组,两者BK含量分别是70.50±2.46 pg/ml和80.15±1.78 pg/ml,VEGF含量分别为106.73±3.82 pg/ml和111.89±9.77 pg/ml。4.与假手术组相比,pMCAO组大鼠神经功能缺损评分明显升高（P<0.05）;海马区神经元损伤明显,锥体细胞排列不规则,出现细胞肿胀,细胞膜结构弥漫,神经元变性/坏死;脑梗死体积增加（P<0.05）;S100β和NSE标志物表达增高（P<0.05）;促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达显著升高,抑炎因子IL-10表达明显降低（P<0.05）;海马区细胞凋亡数量增加,差异有统计学意义;促凋亡因子Bax和Caspase3表达显著增高,抑凋亡因子Bcl-2表达明显降低（P<0.05）。5.与pMCAO组相比,动脉泵入HUK可以显著降低大鼠神经功能缺损评分（P<0.05）,有效改善海马区神经元损伤,减少神经元变性/坏死;显著降低大鼠的脑梗死体积（P<0.05）;显著降低S100β和NSE蛋白的表达（P<0.05）;显著降低促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,提高抑炎因子IL-10的表达（P<0.05）;显著降低大鼠海马区细胞凋亡的数量,降低促凋亡因子Bax和Caspase3的表达,提高抑凋亡因子Bcl-2的表达（P<0.05）。6.与pMCAO+HUK组相比,PI3K抑制剂组减弱了HUK对大鼠的大脑神经功能保护作用,降低了HUK对PI3K、AKT和FoxO1的磷酸化水平,表明动脉泵入HUK对pMCAO大鼠神经功能的保护作用可能通过PI3K/AKT/FoxO1信号通路得以实现。研究结论1.在不同时间窗内,局部动脉泵入不同剂量的HUK对pMCAO大鼠具有显著的神经保护作用。2.在pMCAO后0.5 h,局部动脉泵入HUK中剂量(15.625×10-4 PNAU/Kg)对pMCAO大鼠的神经保护作用最为显著。3.局部动脉泵入HUK对pMCAO大鼠的脑神经具有保护作用,可能与缓激肽系统相关。4.动脉泵入中剂量HUK可以改善pMCAO大鼠的神经功能缺损评分,减少脑梗死体积,抑制炎性因子表达和神经细胞凋亡,表明HUK对pMCAO大鼠的神经功能损伤具有保护作用。5.PI3K抑制剂可以逆转HUK改善pMCAO大鼠的神经功能缺损评分,脑梗死体积缩小,抑制炎性因子的表达和神经细胞凋亡的降低,表明PI3K抑制剂可以降低HUK对pMCAO大鼠的神经保护作用。6.动脉泵入HUK对pMCAO大鼠的神经保护作用机制,可能与调控PI3K/Akt/FoxO1信号传导途径相关。