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IgY是鸭体内中主要的免疫球蛋白分子之一,其在鸭体内有两种形态的分子,即完整型IgY分子和缺失型IgY分子。本课题研究目的在于制备抗鸭IgY Fc片段CH3-CH4单克隆抗体,这样就能够检测出鸭血清中完整型IgY分子。此外抗鸭IgY Fc片段CH2的单克隆抗体可以既可以检测到缺失型IgY分子也可以检测完整型IgY分子。1：鸭IgY Fc片段CH2-CH3-CH4基因的克隆与序列分析以BSA免疫樱桃谷肉鸭的脾脏提取总RNA,经RT-PCR扩增含有CH1部分序列的IgY Fc片段CH1-CH2-CH3-CH4,大小为1154bp,将目的基因与T载体连接,pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4重组质粒测序分析结果表明在CH2-CH3-CH4基因中存在4个碱基的突变,核苷酸同源性为99%,其突变均为无义突变,氨基酸同源性为100%。以此为模板扩增CH2-CH3-CH4基因,大小为954bp.2：鸭IgY Fc片段CH2, CH3-CH4及CH1-CH2-CH3-CH4基因的原核表达以pMD-18T-CH1-CH2-CH3-CH4为模板成功扩增CH2, CH3-CH4, CH1-CH2-CH3-CH4基因,大小分别为288bp,666bp和1154bp。将目的基因分别与原核表达载体连接构建原核表达载体pGEX-KG-CH1-CH2-CH3-CH4, pET-28a-CH2, pET-28a-CH3-CH4。经SDS-PAGE检测诱导表达融合蛋白GST-CH1-CH2-CH3-CH4,大小约为48KDa,经Western blot鉴定后将纯化表达蛋白进行Balb/c小鼠的免疫,制备单克隆抗体。经SDS-PAGE检测诱导表达的融合蛋白His-CH2和His-CH3-CH4,大小分别为17KDa和26KDa。经Western blot鉴定后将纯化蛋白作为包被抗原用于单克隆抗体的筛选。3：抗鸭IgY Fc片段单克隆抗体的制备用纯化的融合蛋白GST-CH1-CH2-CH3-CH4免疫Balb/c小鼠,经细胞融合后筛选出能够分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株4F8,4H11,4A2和4A4。其中4F8株单克隆抗体的亚类为IgG3,效价达到1：1.024×106,纯化后的4F8单克隆抗体在稀释度为16000倍时能够与His-CH3-CH4蛋白结合,4F8单克隆抗体Western blot鉴定结果表明其与完整型鸭IgY和鸡IgY能够结合。