研究背景深静脉血栓形成(deep vein thrombosis, DVT)是一种严重的,具有潜在危险的疾病,如未得到适当治疗易发展为血栓形成后综合征、股青肿、股白肿甚至发生肺栓塞而死亡。流行病学研究提示,深静脉血栓形成年发病率为1.60‰～1.82‰。回顾性研究资料报道,静脉血栓栓塞症患者有高达5%-23%的死亡率,即使正规服用抗凝剂的有症状患者,死亡率也有1%-2%。而深静脉血栓形成患者有三分之一发生血栓形成后综合征,肺栓塞患者4%-5%发生肺动脉高压。此外,深静脉血栓形成的治疗效果又不确切。因此,研究深静脉血栓形成的病因、发病机制和治疗至关重要。本研究分两大部分,第一部分探讨静脉血栓形成的病因学,研究亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR) C677T和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase, MTRR)A66G基因多态性与深静脉血栓形成的关系,试图发现国人静脉血栓形成的易感因子。第二部分为静脉血栓形成基因治疗的体外实验研究,以腺病毒介导的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-type plasminogen activator,uPA)基因转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endotheliocyte, HUVEC),研究转uPA基因感染人脐静脉内皮细胞后的蛋白表达以及纤溶活性改变情况,试图探讨uPA基因治疗静脉血栓形成的可行性和可能机制。第一部分MTHFR C677T和MTRR A66G基因多态性与深静脉血栓形成的关系目的:研究亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)基因和蛋氨酸合成酶还原酶(methionine synthase reductase, MTRR)基因的多态性与深静脉血栓形成的关系,探讨深静脉血栓形成的病因学。方法:采用病例对照研究,以101例下肢深静脉血栓形成患者和同期行健康体检的正常人群120例(对照组)的血白细胞为样本,应用等位基因序列特异性引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction-sequence specific primer ,PCR-SSP)多态性技术检测两组的MTHFR基因第677位点的多态性和MTRR基因第66位点的多态性,分别比较每两组的基因型和等位基因的分布频率。同时统计下肢深静脉血栓形成的发病部位。结果:MTHFR的677位点CC、CT和TT基因型频率在疾病组中分别为41.58%、25.74%、32.67%,在对照组中分别为58.33%、23.33%、18.33%,MTHFR的677位TT基因型频率与对照组的比较差异有显著性(χ2=7.7,P<0.05)。MTRR的66位点AA、AG和GG基因型频率在疾病组中分别为26.76%、43.66%、29.58%,在对照组中分别为43.57%、44.28%、12.14%,两组的分布频率差异无显著性(P>0.05)。左下肢深静脉血栓形成的发病率为83.2%。结论:MTHFR基因第677位点的TT基因型多态性可能与DVT的发病有关。MTRR基因A66G多态性可能不是DVT的独立遗传危险因素。下肢DVT好发于左下肢。第二部分腺病毒介导uPA基因转染人脐静脉内皮细胞的体外实验研究目的:构建含有人uPA基因的重组腺病毒载体,利用重组腺病毒载体介导人uPA基因转染人脐静脉内皮细胞,从基因、蛋白水平检测目的基因uPA的蛋白表达和纤溶活性,探索静脉血栓形成基因治疗的可行性和可能机制。方法:用PCR将合成的oligo拼接成完整的uPA基因,将合成好的目的基因序列装入pMD-18T载体,经XhoI和SalI酶切将目的基因uPA克隆到含增强绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的质粒载体pIRES2-EGFP中,并转化至感受态细胞DH5α。以pIRES2-EGFP质粒为模板,扩增带attB1和attB2的uPA-IRES2-EGFP片段。采用pAD/CMV/V5-DEST Gateway Vector载体系统作为载体,该系统是缺失了E1和E3早期区的AD5型腺病毒,可容纳6～8.5 kb的外源基因,外源基因插入到E1区。以Gateway两步重组技术重组腺病毒质粒:BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上,LR重组系统将目的序列重组到腺病毒质粒载体pAD/CMV/V5-DEST上,测序验证重组质粒的正确性,构建含有人uPA基因的重组腺病毒载体。Pac I将重组腺病毒载体质粒线性化后用脂质体lipofectamine 2000转染293A细胞进行包装并对病毒液进行扩增、纯化和滴度测定。HUVEC细胞培养后实验分3组:ad.uPA转染组,ad.neg空载体对照组和空白对照组(n=3)。分别以重组腺病毒载体介导的人uPA基因、空载体对照和空白对照转染HUVEC细胞,观察转uPA基因对HUVEC细胞的影响,测定最佳感染复数((multiplicity of infection, MOI);采用实时荧光定量聚合酶链反应(real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction , FQ-PCR)、免疫印迹(Western Blot)和酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测转uPA基因在HUVEC的蛋白表达;比色法检测转uPA基因在HUVEC细胞上清中的的纤溶活性变化。结果:成功克隆了人uPA基因,并将携带EGFP的目的基因uPA克隆至质粒载体pIRES2-EGFP,成功构建了uPA cDNA的质粒载体puPA-IRES2-EGFP,测序结果与Genebank公布的人uPA基因cDNA序列完全一致,同源性为100%,该基因编码的蛋白为人uPA。成功构建了人uPA基因重组腺病毒载体pAD-ZWM-PLAU,重组腺病毒载体pAD-ZWM-PLAU经PacI酶切后用Lipofectamine 2000能有效转染293A细胞,包装成功,获得了人uPA基因重组腺病毒ad.uPA。经大量扩增、纯化后病毒滴度为5.74×1010ifu/ml。本研究制备的人uPA基因重组腺病毒ad.uPA感染HUVEC细胞后最佳MOI=800。以MOI=800感染HUVEC细胞后,FQ-PCR检测ad.uPA组、ad.neg组和control组三组目的基因2 -⊿⊿ CT分别为15.2422、4.5631和1,显示阳性感染病毒细胞中目的基因表达量有明显提高(P<0.01)。Western Blot检测结果示ad.uPA侵染病毒的细胞目的蛋白表达量明显提高,而侵染阴性腺病毒对照组和空白对照组的HUVEC细胞中几乎没有检测到目的蛋白的表达。目的蛋白大小为55 kDa。ELISA检测转基因HUVEC培养上清uPA含量结果ad.uPA转基因组,ad.neg空载体组和空白对照组分别为379.4043±2.46 ng/L,240.0099±1.16 ng/L和256.1024±3.04 ng/L,ad.uPA转基因组uPA蛋白含量明显高于空载体组和空白对照组(P<0.01)。比色法检测转基因HUVEC细胞uPA活性结果ad.uPA转基因组,空载体组和空白对照组分别为68.3062±0.64 IU/106cells/24h,5.1845±0.19 IU/106cells/24h和5.0299±0.12 IU/106cells/24h,ad.uPA转基因组uPA活性明显高于各对照组(P<0.01)。结论:成功构建了EGFP和uPA双表达重组腺病毒载体pAD-ZWM-PLAU,并于HUVEC成功表达,为静脉血栓形成的基因治疗奠定了基础。转uPA基因感染HUVEC细胞后从基因、蛋白水平均可检测到明显的目的基因表达和纤溶活性增高。外源性基因表达的蛋白在在体情况下有否生物学作用,还有待于动物实验来证实。本研究为静脉血栓形成的基因治疗方案的制定进行了有益的探索。