到目前为止,对多种神经性疾病的研究表明,这些疾病产生的原因是相关蛋白的构象发生了变化。研究还发现,除了与疾病相关的蛋白,其他与疾病不相关的蛋白质在适当条件下也会形成淀粉样纤维。蛋白质淀粉样纤维的形成是个极其复杂的过程,在此过程中有原纤维、寡聚体和一些不规则的聚集物等许多中间体产生。不管是成熟纤维还是中间体只要是沉积在人体的各个组织或器官,都会在细胞膜上聚集,从而导致细胞凋零死亡,最终引起淀粉样变性疾病。例如：老年痴呆症、帕金森综合症及Ⅱ型糖尿病等。因此,淀粉样纤维化是蛋白质的共性。然而作为生物体主要构成的部分蛋白质,在生物的生命活动中起着重大作用,所以对蛋白质淀粉样纤维化进行深入的研究显得尤为重要。近年来,越来越多的物质被用作阻滞蛋白质纤维化的抑制剂,而表面活性剂种类繁多,几乎覆盖所有行业,是一类灵活多样,用途广泛的物质。目前,虽然研究表明某些表面活性剂对蛋白质变性有一定作用,但仍存在很多问题需要解决,因此作进一步探索十分必要。本文采用鸡蛋清溶菌酶(HEWL)和牛血清白蛋白(BSA)作为研究蛋白,分析溶菌酶和BSA淀粉样纤维化过程中蛋白质二级结构的转变、疏水区暴露的情况及构象的变化。研究纤维生长的动力学机制、形态、物理性质和红细胞毒性。另外,在孵育蛋白时选择加入两性表面活性剂磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,缩写PC)、阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfonate,简称SDS)和阳离子表面活性剂十二烷基三甲基氯化铵(Dodecyl trimethyl ammonium chloride,缩写DTAC),探索上述三种物质对蛋白质变性的作用,选出对淀粉样纤维抑制作用最强的活性剂,将为全面评价表面活性剂在神经性疾病的药理作用提供依据。主要实验方法和实验结果：1.溶菌酶与BSA淀粉样纤维的生长的检测ThT是一种阳离子荧光染料,与淀粉样纤维化的p-折叠结构特异性结合,因此用其来检测溶菌酶、BSA在淀粉样纤维化时的生长情况。实验结果显示,溶菌酶淀粉样纤维生长曲线呈“S”型,即符合一般动力学特征延滞期-生长期-稳定期,而且在纤维化的过程中伴随a-螺旋逐渐减少,β-折叠逐渐增加。BSA淀粉样纤维生长曲线并不呈“S”型,即无成核期也就是没有经历延滞期,并且其纤维化过程中β-折叠结构的含量随着孵育一开始就增加,达到最大值后逐渐平缓。2. SDS-PAGE检测溶菌酶与细胞膜的作用通过SDS-PAGE检测红细胞膜蛋白分别与不同的溶菌酶纤维的相互作用,分析红细胞膜蛋白谱带,发现成熟的纤维因其对红细胞膜蛋白有损伤作用,可以诱导膜蛋白聚集体形成。加入不同表面活性剂所形成的淀粉样纤维与细胞膜作用后,有的可以抑制膜蛋白的聚集,有的反而对其有促进作用,而且膜蛋白的聚集量与蛋白孵育时间成正比。实验结果表明,对红细胞有毒性的是溶菌酶纤维并不是溶菌酶蛋白。3.检测红细胞溶血作用和聚集选用人的红细胞为模型,测定加入表面活性剂的溶菌酶淀粉样纤维样品的紫外吸光度值来检测纤维对红细胞的毒性强弱。实验结果表明,不论纯溶菌酶淀粉样纤维还是加入抑制剂的溶菌酶淀粉样纤维都对红细胞有毒性。单就加入PC和对苯醌及只有PC所形成的纤维对红细胞的溶血作用来看,二者对细胞毒性大小差异不大,因此PC与对苯醌并没有协同作用。红细胞经过成熟溶菌酶纤维处理后,通过偏振光显微镜观察红细胞都发生了一定程度的聚集,其中有的细胞还发生形状的变化,边缘出现棘突。加入PC、对苯醌和DTT的溶菌酶纤维导致红细胞的聚集有所减缓,红细胞的形态也大部分没有发生形变。4.溶菌酶和BSA淀粉样纤维形态的检测透射电子显微镜是检测纤维形态最常用的技术。成熟的溶菌酶纤维呈现网状和长条丝状,当有表面活性剂PC、SDS和DTAC存在的情况下,纤维形态发生变化。而成熟的BSA纤维呈现蠕虫状,在SDS的存在时,纤维的形成受到了抑制,视野中只能看到有少许纤维生成。5.BSA淀粉样纤维的表面疏水区的检测ANS是检测蛋白质疏水区暴露程度的一种荧光染料,通过和蛋白质的疏水区域结合,ANS的荧光发射波长和荧光强度均可能发生变化。ANS在没有和蛋白结合的情况下,在530nm处有最大荧光发射峰。当与蛋白质分子结合后,荧光峰出现蓝移,随着蛋白质分子表面疏水性的改变,ANS荧光强度会随之改变,最大发射波长会继续蓝移。实验结果显示BSA淀粉样纤维化过程中,随着孵育时间的增加,ANS的荧光强度逐渐下降,同时最大吸收波长没有出现明显的蓝移现象。结论：溶菌酶、BSA在适合实验条件下均可形成淀粉样纤维,过程都伴随β-折叠增加和疏水区域暴露等相同的特点,不同的是纤维生长曲线不同,这是由于二者的分子量和蛋白结构的差异所造成的。实验选用PC浓度小于其临界胶束浓度CMC时,对溶菌酶有一定的抑制作用,可能是因为PC与p-片层结构结合从而干扰了p-折叠的延伸,阻碍了纤维的形成。PC也可以抑制BSA纤维化,原因可能是PC的疏水基团与BSA分子的疏水腔之间相互排斥,进而抑制BSA淀粉样纤维化。SDS可以促进溶菌酶淀粉样纤维的生成,却对BSA有较强的抑制作用,并且抑制作用与SDS浓度呈正相关。可能是由于两种蛋白孵育条件及等电点不同所导致的,若孵育时的pH低于蛋白的等电点pI, SDS对其就有促进作用,反之则起抑制作用。DTAC对溶菌酶和BSA淀粉样纤维形成都有作用。通过SDS-PAGE实验结果可以得到,纯溶菌酶纤维对细胞有毒性,膜蛋白在纤维作用下产生聚集体。有PC存在下,纤维对细胞的毒性有所减缓,膜蛋白在进样孔有少许的聚集。当有SDS时,膜蛋白在溶菌酶纤维作用下在进样孔有许多的聚集体,增强了纤维对细胞的毒性。而有DTAC存在时,DTAC浓度不同时纤维对细胞的毒性也不同。