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白细胞介素18(Interleukin-18, IL-18)主要由单核-巨噬细胞系分泌，在结构上属于IL-1家族，在功能上与IL-12相似，而且与IL-12有协同效应，是重要的调节先天性免疫和获得性免疫的细胞因子。评价IL-18在机体内的动态变化水平，对于了解传染性疾病的发生、发展、转归情况及其机体保护性免疫反应动态规律有着重要的意义，本课题组也已发现并报道了鸡IL-18的转录水平与家禽肿瘤病毒感染之间存在的相关性。鉴于此，有必要建立检测IL-18蛋白在机体中水平变化的方法。迄今为止，尽管国内外已有多种动物的商品化IL-18夹心ELISA试剂盒，但尚未见有国产的鸡白细胞介素18成熟蛋白(mature chicken interleukin-18, mChIL-18)夹心ELISA试剂盒。本研究旨在利用重组ChIL-18蛋白(recombinant ChIL-18, rChIL-18)和识别不同表位的抗ChIL-18单克隆抗体(mAb)建立ChIL-18双抗体夹心ELISA检测方法，从而为监测鸡体免疫状态和研究鸡体免疫机制提供技术平台。将实验室已构建的含有mChIL-18基因的重组原核表达质粒pET-28a-mChIL18在大肠杆菌中进行高效表达，采用Ni-NTA亲和层析方法纯化重组蛋白，免疫BALB/c小鼠，经融合、筛选制备特异性单克隆抗体，并通过间接ELISA、间接免疫荧光(IFA)和Western-blot等方法对mAb做初步鉴定。结果表明，试验成功表达了mChIL-18蛋白，并最终获得1株持续且稳定分泌抗体的杂交瘤细胞(1B10)，其腹水ELISA效价为1:3.2×104，亚类鉴定结果为IgM。Western-blot结果显示，单抗能特异性识别原核表达的mChIL-18蛋白，IFA分析表明单抗能与真核表达的mChIL-18发生特异性反应。将1B10与实验室已制备的针对不同抗原表位的另外2株单克隆抗体(1G9、2E6)通过ELISA叠加试验进行抗原表位分析，结果表明，1B10与1G9针对同一抗原表位。应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白的2株单克隆抗体1G9和2E6，建立检测mChIL-18的单抗包被-单抗检测的双抗体夹心ELISA方法，并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒(reticuloendotheliosis virus, REV)人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示，包被抗体的最佳质量浓度为8μg/mL，检测抗体的工作效价为1:800，待检样品的最佳稀释度为1:400，检测敏感度可达31.5pg/mL，与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应；跟对照组相比，REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈现升高，但只有14日龄时表现差异显著(p<0.05)。同时应用鸡白细胞介素18成熟蛋白的多克隆抗体和单克隆抗体1G9，建立了检测mChIL-18的多抗包被-单抗检测双抗体夹心ELISA方法，并利用此方法对前述临床样品进行了检测。结果显示，包被抗体的最佳质量浓度为20μg/mL，检测抗体的工作效价为1:800，待检样品的最佳稀释度为1:400，与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应；跟对照组相比，REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7d、14d、21d、28d、35d、42d和49d均呈现升高，但只有42日龄时表现差异显著(p<0.05)。上述结果表明，本试验成功建立了ChIL-18的两种双抗体夹心ELISA，为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。