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酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）作为极具潜力的真核微生物细胞工厂,被广泛的应用于各种化学产品、医药保健品和生物燃料的合成。丙二酰辅酶A（malonyl-CoA）作为一种中间代谢物,是合成多种重要化学品的前体,包括聚酮化合物、黄酮类化合物、脂肪酸衍生物等。然而在酿酒酵母中,丙二酰辅酶A的合成与代谢受到严格的调控,导致丙二酰辅酶A代谢通量低,限制了下游产品的合成。尽管目前已经有研究利用代谢工程对丙二酰辅酶A合成途径进行改造,增加其合成通量,但进一步筛选可增强丙二酰辅酶A合成的新基因,对于继续提高下游产物的合成至关重要。丙二酰辅酶A是代谢中间产物,其检测非常困难,因此,有必要建立一种简单高效的方法来进化筛选高产突变菌株,并筛选鉴定提高丙二酰辅酶A下游产物的关键基因,用于提高丙二酰辅酶A下游产物合成。前期课题组已经构建了丙二酰辅酶A激活型生物传感器,并偶联荧光进行丙二酰辅酶A羧化酶的突变和筛选。在本论文,我们首次在酿酒酵母中构建了感应丙二酰辅酶A的抑制型生物传感器,并通过激活蛋白的选择、转录因子结合位点的数量和位置以及启动子强度的筛选,优化了该生物传感器。在此基础上,利用前期构建的丙二酰辅酶A激活型生物传感器和本研究构建的抑制型生物传感器,建立了基于生长的筛选系统,将代谢物浓度与酿酒酵母的生长速率偶联起来。此外,通过改造DNA复制和修复系统构建了酵母体内连续突变系统。将生长筛选系统和体内突变系统偶联,快速地筛选到提高丙二酰辅酶A通量的突变菌株,并通过全基因组测序、转录组分析和反向工程验证鉴定了提高丙二酰辅酶A合成的关键基因,发现改变碳水化合物的存储和减少赖氨酸和精氨酸的合成可以有效地提高丙二酰辅酶A的合成通量。本文的具体研究如下:（1）丙二酰辅酶A抑制型生物传感器的构建与优化目前酿酒酵母中大部分生物传感器的设计是激活型生物传感器,抑制型生物传感器非常少。本研究,首次在酵母中构建了丙二酰辅酶A的抑制型生物传感器,其原理是利用FapR转录因子融合激活蛋白,当丙二酰辅酶A浓度低时,FapR-AD结合到启动子上,促进下游基因的激活,而丙二酰辅酶A浓度高时,丙二酰辅酶A与FapR特异性结合,促使其从启动子上解离,转录被抑制。为提高生物传感器的灵敏度,首先对不同的激活蛋白（包括酵母内源的Gal4、Med2;异源的VP16;杂合激活蛋白Med2-Gal4和三联体VPR）的激活效率进行了比较。其中,Med2的激活效果最佳,能够达到46.4倍,高于常用的杂合激活蛋白VPR。当添加到20μM饱和浓度的浅蓝菌素,提高胞内的丙二酰辅酶A浓度时,其解激活效率可以达到72%。此外,对转录因子结合位点fapO在启动子上的位置和数量也进行了优化,发现当1个fapO置于LEU2启动子的上游激活区域内部时,其激活效果最高,达到53.5倍。在添加饱和浓度的浅蓝菌素后,其解激活效率可以达到82%。此外,利用该设计原理构建了其他代谢物（脂酰辅酶A,木糖）的生物传感器,为构建其他代谢物的生物传感器提供了设计原则。（2）构建体内突变系统和代谢物生长偶联方法筛选丙二酰辅酶A高产菌株为筛选提高丙二酰辅酶A合成的突变菌株,首先构建了代谢物浓度偶联的生长筛选系统,利用前期构建的丙二酰辅酶A激活型生物传感器和本研究构建的抑制型生物传感器分别控制抗生素耐药性基因KanMX和毒性基因FCY1的表达。其中,利用激活型生物传感器控制kanMX的表达,表现出较好的生长偶联特性。为了进一步证实抗性条件下的生长速率与丙二酰辅酶A通量的相关性,构建了两株胞内的丙二酰辅酶A浓度不同的菌株（ACL01和ACL02）。通过比较荧光强度、生长速率、丙二酰辅酶A浓度和3-羟基丙酸（3-hydroxypropionic acid,3-HP）,证实了两株菌株的最大比生长速率与丙二酰辅酶A浓度之间具有较好的偶联性。此外,通过在酵母中引入易错的DNA聚合酶δ（polδ）并结合改造的错配修复系统,建立了体内连续突变系统,使基因组复制过程的突变率达到8.3 × 10-5,增加了 2个数量级,实现了菌株在传代过程中不断产生突变。将体内突变系统偶联基于代谢物的生长筛选系统,快速地获得了 4株丙二酰辅酶A合成提高的突变体。（3）多组学分析探寻提高丙二酰辅酶A代谢通量的关键基因为探寻影响丙二酰辅酶合成的关键基因,对筛选获得的4个突变菌株进行了全基因组测序和转录组分析。分析4个突变菌种中发生的共性突变的基因以及转录水平发生显著变化的基因,并通过反向验证分析这些基因对丙二酰辅酶A下游产物3-HP合成的影响。在全基因组测序分析中,与存储性碳水化合物的合成和代谢有关的INO1、PGM3、UGP1和GDB1可影响3-HP的产量。通过对上述菌株糖原含量的测定,进一步确定了调控存储性碳水化合物的合成可以有效地提高丙二酰辅酶A的代谢通量。在转录组分析中,突变菌株的2-氧代羧酸代谢、精氨酸和赖氨酸合成途径相关基因在4个突变菌株中都发生显著下调。通过调控赖氨酸和精氨酸代谢,特别是敲除LYS2和ARG3基因,使丙二酰辅酶A下游产物3-HP的产量分别增加了约78%和82%。精氨酸和赖氨酸的合成需要乙酰辅酶A,赖氨酸和精氨酸途径的下调减少了乙酰辅酶A的消耗,从而增加了丙二酰辅酶A合成通量。通过生长偶联筛选方法的建立和高产菌株筛选、关键靶标鉴定,我们发现了提高丙二酰辅酶A合成的新途径。综上所述,本论文首次在酿酒酵母中构建感应丙二酰辅酶A等代谢物的抑制型生物传感器。在此基础上,利用生物传感器建立了代谢物与生长偶联的筛选系统,并将其与体内连续突变系统结合,快速获得提高丙二酰辅酶A合成通量的突变株。本研究不仅提出了酿酒酵母代谢物生物传感器的设计原则,还开发了新的高通量筛选方法,是目前高通量筛选现有方法的有力补充。