实验猪NLRC5基因特征分析及调控SLA-Ⅰ类分子表达的机制研究

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主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)是一类紧密连锁并显示高度多态性的基因群,其编码的蛋白是一种细胞表面的糖蛋白,参与免疫调节。已报道NLR(NOD-like receptors)家族中最大蛋白NLRC5(NLR family CARD domain containing 5)被鉴定为MHC I类分子的反式激活因子。目前关于猪NLRC5基因的功能以及与猪MHC(也叫Swine Leukocyte Antigen,SLA)I类分子的相关性研究甚少。为了解猪NLRC5基因特征,以不同SLA-Ⅰ类单倍型的猪肺为实验材料,对猪NLRC5 CDS区进行PCR扩增,获得序列与参考序列进行对比,结果显示,不同SLA单倍型猪中NLRC5序列仅个别碱基发生突变,因此,猪NLRC5基因具有一定的保守性。不同物种间同源性和遗传发育树结果显示,猪NLRC5与牛和绵羊的亲缘关系较近,与鸭和斑马鱼的亲缘性较远。目前尚无检测猪NLRC5蛋白的抗体,于是体外构建原核表达载体p ET30a-NLRC5-A,将其进行IPTG诱导表达后发现,NLRC5-A以包涵体的形式存在,纯化的NLRC5-A蛋白免疫兔,检测抗体效价合格后,通过Western blot检测猪NLRC5蛋白发现清晰的目的条带,表明猪NLRC5多克隆抗体制备成功。已报道NLRC5是SLA-Ⅰ类分子的主要调控因子,因此为探究猪NLRC5在猪肾(PK15)细胞中的表达情况及其对猪SLA-Ⅰ类分子表达的调控作用,用poly I:C刺激PK15细胞后,利用荧光定量PCR(q PCR)和Western blot方法分别检测NLRC5的表达量,与此同时,在传代PAMs上,分别加入外源性IFN-β和IFN-γ检测NLRC5的表达量。结果显示,与正常组相比,NLRC5 m RNA和蛋白表达均增加。随后在PK15细胞中敲低和过表达NLRC5,采用q PCR和流式细胞技术(FCS)检测SLA-Ⅰ类分子的表达,结果发现NLRC5表达和SLA-Ⅰ类分子表达呈正相关性,表明NLRC5对SLA-Ⅰ类分子的表达具有正调控作用。前期研究已发现猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)感染原代肺泡巨噬细胞(PAMs)24 h后,NLRC5和SLA-Ⅰ类分子表达下调,本研究采用PRRSV感染一种传代PAMs,利用q PCR、Western blot和FCS检测NLRC5和SLA-Ⅰ参与的抗原提呈相关分子的表达,发现NLRC5、SLA-Ⅰ、β2M、LMP2、LMP7、TAP2、TAP1在m RNA转录水平和蛋白水平上的表达均下调。随后在传代PAMs中分别过表达和敲低NLRC5后再接毒处理,利用q PCR、Western blot、FCS的方法检测传代PAMs内SLA-Ⅰ参与的抗原递呈分子表达量的变化,结果表明,与只接毒相比,敲低NLRC5后再接毒,SLA-Ⅰ类分子以及抗原递呈相关分子表达明显减少,PRRSV的复制增加;过表达NLRC5后再接毒,SLA-Ⅰ类分子以及抗原递呈相关分子表达增高,同时抑制了PRRSV的复制,因此得出,在PRRSV感染早期通过下调NLRC5的表达从而下调SLA-Ⅰ参与的抗原提呈相关分子的表达,同时发现NLRC5在抗PRRSV免疫应答中起着重要的作用。NLRC5在抗病毒免疫应答中发挥重要作用,本研究分析了猪NLRC5基因特征及与SLAI参与的抗原提呈相关分子表达的相关性,可为实验猪先天免疫研究提供新思路,也可为猪重大疫病的防控研究奠定基础。
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