桔小实蝇Bactrocera dorsalis(Hendel),是世界性重要检疫性害虫,其寄主广泛,繁殖能力强,防治困难。桔小实蝇成虫羽化后必须经历一段时间才能达到性成熟并交配产卵,因而性成熟过程是控制虫害的重要切入点。因此通过研究桔小实蝇雌成虫生殖发育过程相关分子机理,不仅可以丰富和完善昆虫生殖调控分子机制,而且为桔小实蝇绿色可持续治理提供新思路和新方向。本研究从实验室前期已有的桔小实蝇雌成虫卵巢与脂肪体组织小RNA文库中筛选高丰度表达的miRNA,利用荧光定量PCR技术(qRT-PCR)检测其在雌成虫脂肪体和卵巢组织不同生殖发育阶段的表达模式,选取不同生殖发育时期差异表达并且在卵巢组织高表达的新型miRNA(Predicted Candidate,pc)pc-3p-116,利用显微注射miRNA类似物(agomir)等方法检测其在桔小实蝇卵巢发育、繁殖力中的功能;通过靶基因预测、双荧光素酶验证、RNAi等技术明确其调控桔小实蝇雌成虫生殖发育的分子机理。1.桔小实蝇雌虫生殖发育时期差异表达miRNA鉴定及时空表达模式研究从实验室前期已有的桔小实蝇雌成虫卵巢与脂肪体组织小RNA文库中筛选出高丰度表达的12个miRNA,其中包括8个已知miRNA和4个未命名的miRNA。qRT-PCR检测其在雌成虫脂肪体和卵巢组织不同生殖发育阶段的表达模式,结果表明,6个miRNA在雌成虫不同生殖发育时期具有差异性表达。其中,pc-3p-116在卵巢和脂肪体中的表达量均随着组织发育成熟呈现下调趋势,let-7-5p、miR-34-5p、miR-263a-5p、pc-3p-1934、miR-2b-3p均在雌成虫性成熟时期表达量上调。推测这6个miRNA参与调控桔小实蝇雌成虫的生殖发育过程。进一步检测这6个miRNA在雌成虫羽化第1天和羽化第13d(性成熟时期)不同组织中的表达模式,结果表明,pc-3p-116在卵巢中高表达,并且随着卵巢发育成熟表达量显著性降低。因此,我们选择pc-3p-116进行下一步功能研究。2.miRNA pc-3p-116功能研究通过显微注射技术将pc-3p-116类似物注射至桔小实蝇雌成虫体内,检测其在生殖发育中的功能。结果显示,处理组卵黄沉积减少,卵巢发育被抑制;交配后15d内产卵总量(353粒)显著低于对照组(700粒),而且日平均产卵量均低于对照组,其中第3d、5d、7d、9d、11d、13d单雌产卵量具有显著性差异;处理组和对照组卵的孵化率分别为55%、75%,具有显著性差异。以上结果表明,pc-3p-116参与调控桔小实蝇雌成虫卵巢发育和繁殖力。为了进一步研究pc-3p-116调控桔小实蝇雌成虫生殖发育的分子机理,采用TargetScan、miRanda软件分别预测pc-3p-116的潜在靶基因,选取两个软件预测的交集,共筛选获得6个潜在靶基因,分别为细胞色素P450家族基因CYP6a14,Cullin家族基因cullin2,E3蛋白质连接酶E3 SUMO-protein ligase PIAS2,核激素受体基因FTZ-F1,Endophilin家族基因Endophilin B1,核受体共激活因子coactivator2。注射pc-3p-116类似物之后,CYP6a14、cullin2、Endophilin B1、PIAS2表达量显著性降低;其中,CYP6a14和Endophilin B1的表达量在桔小实蝇雌成虫性成熟期显著上调,与pc-3p-116的表达模式呈相反趋势,因此将筛选的CYP6a14和Endophilin B1的3’UTR区分别插入到psiCHECK-2载体中构建双荧光素酶报告载体,与pc-3p-116类似物共转染到HEK293T细胞系中进行双荧光素酶实验,结果显示,CYP6a14和Endophilin B1双荧光素酶报告载体与pc-3p-116类似物共转染时均能够显著降低荧光素酶信号,表明了CYP6a14和Endophilin B1均为miRNA pc-3p-116的潜在靶基因。根据pc-3p-116分别和CYP6a14与Endophilin B1两个基因3’UTR结合位点特异性及自由能等条件,我们选择CYP6a14基因并进一步研究其在桔小实蝇雌成虫生殖发育中的功能。利用RNAi技术沉默雌成虫CYP6a14基因,检测干扰CYP6a14基因之后对桔小实蝇雌成虫卵巢形态、交配率、产卵量、孵化率的影响。结果显示,处理组卵巢出现明显的发育迟缓现象,交配后15d内产卵总量(218粒)显著低于对照组(340粒),并且日平均产卵量均低于对照组,其中第3d、5d、7d、9d、11d、13d、15d单雌产卵量具有显著性差异;处理组和对照组孵化率分别为60%、80%,具有显著性差异,以上结果表明,pc-3p-116通过靶向CYP6a14基因调控桔小实蝇卵巢发育和繁殖力。