论文部分内容阅读
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物,其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因,因此,深入发掘Bt新菌株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。本研究利用温度筛选法,对采自河北保定周边的的182份土壤样品进行分离,得到9株野生型Bt菌株。利用40对通用引物对9株野生型菌株的基因型进行PCR鉴定,分离克隆了对瓢甲科害虫有活性的新型杀虫蛋白基因,构建了新型Bt融合基因,为构建高效广谱的Bt工程菌和培育转基因抗虫植物提供新基因资源。本研究的主要内容和结果如下:1从保定周边采集的182份土壤分离出9株Bt菌株,Bt菌株的平均分出率为4.95%,主要为小菱形、大菱形、方形、不规则形等晶体形态。2.利用40对通用引物鉴定9株野生型Bt菌株的基因型,选择仅含有cry7基因的GW6菌株设计特异性引物cry7Forword/cry7Reverse,将PCR产物连接到pGEM Easy载体进行克隆,由上海生工完成了该基因的全序列测定,该基因核苷酸序列已在NCBI和GenBank中登记(Accession number:FJ940776),并由国际Bt-δ-内毒素基因命名委员会正式命名为cry7Ab7。cry7Ab7基因的读码框(ORF)3414bp,编码1138个氨基酸,亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)和天冬酰胺(Asn)含量最高,分别为8.87%,7.11%,7.11%,预测分子量为129.64kDa。Cry7Ab7蛋白等电点pI 4.97,为弱酸性蛋白。3.将cry7Ab7全长基因插入表达载体pET21b,转化E.coli BL21得到高效表达;利用Bt-E.coli穿梭载体pSXY422b,构建了重组质粒pSXY422b-7Ab7,转化Bt无晶体突变株HD73(cry-),得到工程菌Bt HD7AB,工程菌Bt HD7AB蛋白表达量是野生型菌株的2.6倍。生物测定结果表明,在E.coli中表达的融合蛋白和HD73(cry-)的晶体蛋白对马铃薯瓢虫(Henosepilachna vigintioctomaculata)2龄幼虫的LC50分别为1.1664μg/μL和0.779μg/μL。4.以苏云金杆菌野生型菌株GW6和Bt11总DNA作为PCR反应模板,利用特异性引物CRY7AbF/CRY1IaR融合cry7Ab7和cry1Ia14基因得到融合基因Bt7Ia,克隆得到的全长基因提交GenBank登录号为GU462130。Bt7Ia基因具有Cry7Ab7的DomainⅠ和Cry1Ia14的DomainⅡ和DomainⅢ。将该基因分别插入表达载体pET21b和Bt-E.coli穿梭载体pSXY422b构建了重组质粒pET21b-7Ia和pSXY422b-7Ia,转化E.coli BL21和Bt无晶体突变株HD73(cry-),分别得到E.coli EC7Ia和Bt HD7Ia。在E.coli BL21中的EC7Ia获得了高效表达,而含有cry1I沉默基因片段的融合基因Bt7Ia,在无晶体突变株HD73(cry-)中不表达。生物活性测定表明EC7Ia的表达产物对粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和小菜蛾(Plutella xylostella)的LC50分别为2.0953μg/mL和0.3927μg/mL。这些结果为扩大Bt基因的杀虫谱以及Cry7Ab7和Cry1Ia14各功能域功能的研究奠定了基础。