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高致病性禽流感(HPAI)是由H5和H7亚型禽流感病毒(AIV)引起的禽类急性高致病性传染病,被国际兽疫局(OIE)列为A类疾病,在我国被列为一类传染病。禽流感病毒基质蛋白2(M2)是流感病毒的外膜蛋白之一,氨基酸序列高度保守,在各个亚型流感病毒间同源性很高。禽流感病毒核蛋白(NP)是病毒粒子的内部结构蛋白,至少含有三个以上独立的抗原位点,是细胞毒性T细胞主要的抗原位点。作为抗原,它们都可以诱导产生保护性免疫应答,并具有一定程度的交叉保护力,因此是研究流感通用疫苗的理想抗原。以本实验室构建保存的质粒pET-3M2e和pBV-M2e-Fc为模板,并在引物上引入NP抗原表位(NP1、NP2),经PCR扩增后得到基因片段3M2e-NP1、NP2-Fc、3M2e-NP1/2。人工合成乙肝表面抗原(HBsAg)和破伤风类毒素(TT)的两个通用型T细胞抗原表位PTCEs。将以上基因片段串联起来克隆至原核表达载体pET-32α(+),构建表达载体pET32α-3M2e-NP1/2-Fc、pET32α-3M2e-NP1/2、pET32α-PTCE-3M2e- NP1/2,转化至大肠杆菌BL21-DE3,经IPTG诱导表达。表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blotting检测。结果表明,构建的三种表达载体经过酶切鉴定和测序,证实其插入的片断大小、读码框架正确。所表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,相对分子量分别约为50kDa、31.2kDa、36.2kDa,通过镍亲和层析纯化能够得到条带单一的电泳纯蛋白,经Western-blotting鉴定为阳性,为进一步进行其免疫原性的研究奠定了基础。利用大肠杆菌表达的3M2e-NP1/2-Fc、3M2e-NP1/2及PTCE-3M2e-NP1/2三种蛋白,结合弗氏、白油、壳聚糖、CpG等佐剂,免疫20日龄的非免鸡,首免后每周定期采血,以实验室建立的ELISA方法检测抗M2e抗体水平,在MDCK细胞上检测血清与M2的结合能力,在SPF鸡胚上测定抗血清的中和效价,以流式细胞仪检测外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞数量的变化。结果发现,免疫后各组均能检测到ELISA抗体水平,其中融合蛋白PTCE-3M2e-NP1/2配合弗氏佐剂产生的抗体水平最高,各免疫组在二免后的第四周左右抗体达到高峰。免疫荧光显示免疫组的抗血清能够跟病毒表达在细胞表面的M2特异性结合,但在鸡胚上血清有一定的中和能力。流式细胞仪检测显示外周血CD4~+、CD8~+T淋巴细胞所占比例在免疫后均有不同程度的升高(P<0.05),具有细胞免疫的特征。构建的嵌合肽抗原具有较好的免疫原性,但免疫保护效果需要到有资质的机构进行验证。