【摘 要】
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荔枝(Litchi chinesis Sonn.)是无患子科荔枝属的南亚热带木本果树,荔枝的品种选育主要依靠常规育种,随着生物技术等手段的不断进步,利用细胞工程和基因工程等现代育种方法对荔枝进行品种改良已成为荔枝育种的趋势。本研究以‘黑叶’荔枝品种为实验对象,分别利用‘黑叶’荔枝花药和花后不同天数的幼胚为外植体,诱导出大量愈伤组织,之后以‘黑叶’幼胚诱导出的状态较好的胚性愈伤组织为原始材料,通过体
【基金项目】
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国家荔枝龙眼产业技术体系(CARS-32-05); 广东省‘现代种业’重大科技专项(2018B020202011); 广东“扬帆计划”引进创新创业团队项目(2014YT02H013); 广东省省级农业发展和农村工作专项(粤农计[2017]64号);
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荔枝(Litchi chinesis Sonn.)是无患子科荔枝属的南亚热带木本果树,荔枝的品种选育主要依靠常规育种,随着生物技术等手段的不断进步,利用细胞工程和基因工程等现代育种方法对荔枝进行品种改良已成为荔枝育种的趋势。本研究以‘黑叶’荔枝品种为实验对象,分别利用‘黑叶’荔枝花药和花后不同天数的幼胚为外植体,诱导出大量愈伤组织,之后以‘黑叶’幼胚诱导出的状态较好的胚性愈伤组织为原始材料,通过体细胞胚胎发生的方式初步建立起‘黑叶’荔枝再生体系,并利用GUS基因瞬时表达的方式初步优化了‘黑叶’荔枝的胚性愈伤组织遗传转化体系。主要研究结果如下:(1)以‘黑叶’荔枝花药为外植体,探索出诱导愈伤组织发生的最佳培养基为MS+1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L TDZ+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂,愈伤组织继代培养效果最好的培养基为MS+1 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂。‘黑叶’花药诱导获得的愈伤组织状态不好,呈乳白色且含水量较多,多次继代后,增殖能力降低。(2)‘黑叶’荔枝花后25 d幼胚较适合作为外植体,其愈伤组织最佳诱导和继代培养基均为MS+2 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂。诱导出的愈伤组织呈两种状态:颜色为灰白色、含水量较高的愈伤组织增殖能力弱,为非胚性愈伤组织,其细胞结构疏松、细胞壁明显可见;颜色呈淡黄色或明黄色、含水量适中的愈伤组织增殖能力强,为胚性愈伤组织,其由大小均一且排列整齐的细胞组成,细胞间隔明显。(3)以‘黑叶’幼胚愈伤组织为材料,确定了体细胞胚胎发生的最佳培养基为MS+0.5 g/L AC+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂,体细胞胚胎诱导率可达到100%,大部分为正常胚,正常体胚率高达79.11%;确定体细胞胚胎成熟培养基为1/2MS+1.0 g/L AC+20 g/L蔗糖+8 g/L琼脂,在此培养基上体细胞胚胎既可以生根又可以萌芽,成苗率为0.6%;确定体细胞胚胎萌芽培养基为MS+1.0 g/L AC+1.0 mg/L ZT+30 g/L蔗糖+7 g/L琼脂,在此培养基上已生根的成熟体细胞胚胎的成苗率为0.9%。(4)石蜡切片结果显示愈伤组织细胞形状不规则,结构疏松,排列不整齐,细胞体积较大,细胞壁明显可见。体细胞胚胎由圆形,大小近似,排列整齐,结构紧密且有浓厚细胞质的胚性细胞构成,其发育形态主要可分为球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶形胚等。(5)通过根癌农杆菌介导GUS基因遗传转化‘黑叶’荔枝胚性愈伤组织,初步确定了较适宜进行遗传转化的侵染时间为2h、农杆菌浓度为OD600=0.8,遗传转化率最高可达到85.28%。
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