速激肽(tachytinins)是一类家族肽,由于它能快速地刺激肠平滑肌的收缩,因此而得名。它在进化上比较保守,广泛存在于哺乳动物的中枢神经系统和外周神经系统中,是一类神经递质。速激肽家族包括P物质(substance P)、神经激肽A(neurokinin A)、神经激肽 B(neurokinin B)、神经激肽 K(neuropeptide K)、神经激肽 γ(neuropeptideγ)、HK-1(hemokinin-1)以及多种形式的 EKs(endokinins)(Huetal.,2014)。多种速激肽有不同的基因产物,TAC1编码SP和NKA,TAC3编码NKB,TAC4编码HK-1和EKs,这可能是由于脊椎动物进化过程中发生了基因复制的结果。迄今为止,我们发现的速激肽家族成员的C末端都有一个相同的特点,那就是它们的羧基端都有一段相同的氨基酸序列:Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2,这个结构对受体配体的结合以及其生物活性具有至关重要的作用。NKB是速激肽家族中的重要成员之一,是唯一一个由前激素肽原B合成的速激肽,人类的NKB是由TAC3基因编码,在非灵长类、牛、羊和狗中的NKB是由Tac3基因编码,啮齿动物中的NKB是由Tac2基因编码。不同物种的NKB前体mRNA差异性很大,但是NKB成熟肽却非常保守。NKB在行使其功能时,首先与细胞表面的G蛋白偶联受体NK3R结合,使NK3R活化,诱导质膜上的磷脂酶C活化,产生三磷酸肌醇,升高细胞内Ca2+的浓度,起信号转导作用。除此之外,NKB/NK3R系统还可以使腺苷酸环化酶活化,调节细胞内cAMP的浓度,而cAMP可以激活蛋白激酶A,调节细胞功能。Topaloglu等(2009)发现人类先天性促性腺激素功能衰退症是由于TAC3和TACR3基因的突变引起的,从此,NKB开始受到广大学者的关注。本文以日本鳗鲡为研究对象,研究了 NKB在鱼类生殖调控中的作用。主要研究结果如下:1.利用RACE方法从日本鳗鲡脑组织中克隆得到2种TAC3基因,分别命名为:TAC3a和TAC3b,以及其受体TACR3基因。其中,TAC3a基因的cDNA序列全长为846bp,其中,开放阅读框(ORF)为375bp,编码125个氨基酸,5’UTR为69bp,3’UTR为402bp;TAC3b基因的cDNA序列全长为1011bp,其中,开放阅读框(ORF)为297bp,编码99个氨基酸,5’UTR为180bp,3’UTR为534bp;TAC3受体基因序列长为1239bp,其中,开放阅读框906bp,编码302个氨基酸,5’UTR为192bp,3’UTR为231bp;通过进化树分析,我们证明所得到的序列为日本鳗鲡的TAC3s及其受体TACR3基因;然而,在分析TACR3氨基酸序列时,我们发现,与其他物种相比,日本鳗鲡TACR3提前出现终止密码子,导致该受体胞内部分结构缺失。2.利用RT-PCR的方法对NKB及其受体基因在不同组织器官中的表达量进行检测,结果表明,TAC3a在下丘脑和垂体等脑区表达,此外,还在肝脏和肠等外周组织中发现了 TAC3a的表达,而TAC3b仅在端脑、中脑、视顶盖、下丘脑和性腺中有表达;受体TACR3在端脑、中脑、视顶盖、下丘脑和垂体中都有大量的表达,此外,在心脏、肝脏、肾脏、肠和性腺中也发现了 TACR3的表达。3.由于日本鳗鲡TACR3发生突变,我们进一步针对其是否可以启动下游信号通路进行分析,于是通过受体配体结合实验,证实在COS-7细胞系中,日本鳗鲡NKB多肽无法激活其受体下游信号CRE和SRE通路。4.通过化学合成的方法合成了日本鳗鲡的4种NKB,腹腔注射高浓度(1000ng/g BW)和低浓度(100ng/g BW)的4种成熟肽,发现高浓度的NKBa-10和NKBb-13可以显著的提高mGnRH和FSH的mRNA水平,高浓度的NKBa-10也可以显著上调LH的mRNA的表达量。