Z.mobilis木糖代谢通量分析及关键酶基因的改造

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运动发酵单胞菌属于革兰氏阴性菌,微好氧生长。Z.mobilis是目前发现的乙醇发酵能力最强的微生物之一,被认为是进行大规模乙醇生产的潜在菌种。Z.mobilis 可利用的碳源仅为葡萄糖、果糖和蔗糖。利用基因工程手段改造Z.mobilis,拓宽其可利用碳源的范围,使其能利用五碳糖发酵产醇是当前运动发酵单胞菌基因工程改造工作的首要任务之一。 本研究对已有的Z.mobilis重组工程菌株进行了代谢通量分析。结果表明XI、和TAL是主要的限速酶;为提高Ⅺ的酶活水平,对Z.mobilis基因表达与调控机制进行分析,通过改变相关基因终止密码子之后的序列结构,提高相关基因的表达水平。为此构建了pBSKS-Pgap-xx-L和pBSKS-Pgap-xx-S,即以E.coli染色体为模板PCR扩增片段L(xylB基因下游的一段序列,含一个转录终止子),S(xylB基因下游的一段序列,不含转录终止子),通过酶切位点HindⅢ和EcoT22I与质粒 pBSKS-Pgap-xx连接;进而构建了穿梭质粒pZA22-Pgap-xylAB-L和pZA22-Pgap-xylAB-S,电转进Z.mobilis CP4菌株中。 对基因工程菌株的XI、XK酶活测定结果表明,CP4(pZA22-Pgap-xylAB-L)XI酶活为0.195U/min/mg蛋白;XK酶活为2.159 U/min/mg蛋白,分别比出发工程菌CP4(pZA22-Pgap-xy/AB-O)提高6倍和3.8倍;CP4(pZA22-Pgap-xylAB-S)XI酶活为0.0735U/min/mg蛋白;XK酶活为0.810 U/min/mg蛋白,分别比出发工程菌CP4(pZA22-Pgap-xylAB-O)提高2.3倍和1.4倍。和Z.mobilis菌株CP4相反,在 DH5 α中,DH5 α(pZA22-Pgap-xylAB-L)的酶活水平比DH5 α(pZA22-Pgap-xylAB-S)低,XI分别为0.022 U/min/mg蛋白,0.098 U/min/mg蛋白;XK分别为0.117 U/min/mg蛋白0.642 U/min/mg蛋白。 结果表明终止密码子之后的序列结构对基因表达水平效果明显,但在E.coli和Z.mobilis中的作用机理不同。
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