研究背景心脏成体祖细胞(Cardiac Progenitor Cells, CPCs)治疗是目前心肌细胞再生治疗的新选择。CPCs移植能够改善动物心肌梗死后的心功能。但是CPCs移植后,细胞死亡率高,移植效率低。对细胞进行基因修饰能改善这种情况。整合素连接激酶(]ntegrin Linked Kinase, ILK)是一个多功能的Ser/Thr蛋白激酶,在整合素介导的胞外-胞内信号转导中起关键作用。我们课题组前期研究发现心梗后大鼠即刻心肌内注射高表达ILK基因的腺病毒能显著提高心功能,其机制为激活PI3K/Akt通路,促进细胞增殖,对抗细胞凋亡及促进血管新生。本项目拟用高表达ILK基因的腺病毒转染CPCs,建立小鼠心肌梗死模型后进行ILK-CPCs心肌内注射移植治疗,明确高表达ILK的CPCs移植对促进心肌梗死后心肌和血管再生及心功能恢复的作用并阐明其相关机制,为干细胞修复心肌治疗提供新的选择。研究方法1、以表达ILK及绿色荧光蛋白GFP (ad-GFP/ILK)或仅表达GFP(ad-GFP)的腺病毒载体转染体外培养的小鼠CPCs,确认转染成功后,观察体外高表达ILK基因对CPCs的细胞活力、增殖能力、迁移能力、DNA合成情况、细胞凋亡的影响；2、经开胸结扎冠状动脉前降支构建小鼠心肌梗死模型,立即心肌内注射移植高表达ILK的CPCs,超声心动图检测移植后4周心功能情况,游泳运动试验观察运动负荷能力；移植后3天和4周分别进行免疫荧光检测,观察心梗周围区域移植细胞的存留情况；3、研究高表达ILK对CPCs的作用机制：①Westernblot方法检测ILK下游通路和心室重构相关分子：Akt/p-Akt、Cdc42、Aurora B表达,明确心肌重构情况；②HE染色观察梗死心脏形态；Masson染色检测纤维化程度；CD31染色观察血管新生情况；TUNEL染色检测细胞凋亡情况；4、统计学处理应用SPSS17.0统计软件,所有数据以均数±标准误表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)最小显著差数(LSD)法,p<0.05(双侧)提示有显著的统计学差异。研究结果1、体外实验中,高表达ILK基因能促进CPCs细胞活力(p<0.001)、细胞增殖(p<0.001)、DNA合成(p<0.001)、细胞迁移能力(p<0.001),同时降低Caspase-3活性,减少细胞凋亡(p<0.001),Westernblot显示磷酸化Akt/Akt比例,Cyclin-D1表达增高(p<0.001)；2、体内实验显示,移植后三天,ILK-CPCs组梗死周围区域存留的移植细胞明显增多(p<0.001),4周后两组没有明显差异；高表达ILK的CPCs心肌内注射移植能改善心梗后小鼠4周后心功能,表现为短轴收缩率(FS,p<0.05)升高,左室收缩末直径(LVESD,p<0.05)和左室舒张末直径(LVEDD,p<0.05)降低；动物表现出更好的运动能力,游泳运动时间延长(p<0.05); ILK转染的CPCs移植能改善心肌结构,维持较好的心肌纤维排列,降低纤维化程度(p<0.001),减少细胞凋亡(p<0.05),增加血管密度(p<0.001)。Westerblot显示ILK-CPCs移植后,减少心室重构相关的蛋白包括Cdc42(p<0.001)和Aurora B (p<0.05)都不同程度表达上调。研究结论本研究证实,高表达ILK基因能在体外促进心脏成体祖细胞CPCs的活力、增殖能力、DNA合成能力和迁移能力,减少细胞凋亡,同时磷酸化Akt表达上调。体内实验中,小鼠构建心梗模型后立即心肌内注射移植高表达ILK的CPCs,能改善小鼠4周后的心功能,提高运动能力,这可能与其减少梗死面积,减少纤维化和细胞凋亡,增加血管新生,上调心室重构相关分子表达有关。高表达ILK能改善小鼠心肌梗死后心脏成体祖细胞移植的治疗效果。背景与目的临床上,急性心肌梗死伴2型糖尿病(DM)患者与非糖尿病(NDM)心肌梗死患者相比,表现为心肌缺血更重以及临床结局恶化。究其原因,主要与糖尿病病人微循环障碍及侧枝循环不足有关。骨髓内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells, EPCs)的主要功能是在组织缺血情况下,受缺血区域升高的细胞因子趋化进入循环,归巢至缺血组织参与组织修复以及血管新生。本研究旨在探讨糖尿病患者中,骨髓内皮祖细胞是否存在动员障碍及其具体分子机制。我们观察了急性心肌梗死伴或不伴2型糖尿病病人心梗后一个月内的循环EPCs动员水平以及血浆缺血相关因子SDF-1α、VEGF、hsCRP表达水平,对病人进行随访观察心功能以及心血管事件的发生情况；为了研究骨髓动员障碍机制,我们构建了糖尿病或非糖尿病大鼠急性心肌梗死模型,观察大鼠心梗后一个月内循环EPCs水平以及骨髓EPCs动员相关的p-Akt/p-eNOS/MMP-9通路是否存在异常。方法采用密度梯度离心法分离患者外周血单个核细胞(mononuclear cells, MNCs),用流式细胞仪检测急性心肌梗死后不同时间点(1,3,5,7,14,28天)的外周血CD45-/low+/CD34+/CD133+/KDR+早期内皮祖细胞数量。用ELISA法检测上述不同时间点患者血浆VEGF、SDF-1α以及hs-CRP的浓度。对所有患者进行随访,观察指标包括心功能,主要终点事件、次要终点事件,生存时间,比较两组患者之间有无差异。为了进一步明确内皮祖细胞动员障碍机制,我们采用高脂饮食加STZ腹腔注射法构建大鼠糖尿病模型后,开胸结扎冠状动脉前降支(LAD)构建心梗模型,采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞后,用流式细胞仪检测急性心肌梗死后不同时间点(1,3,5,7,14,28天)的大鼠外周血CD34+/c-Kit+早期内皮祖细胞数量。采集大鼠不同时间点骨髓,采用Westernblot检测大鼠p-Akt, Akt, p-eNOS, eNOS以及MMP-9表达情况,用凝胶酶谱法检测MMP-9活性。心梗后4周,超声心动图检测两组大鼠的心功能,HE染色观察心肌结构,Masson染色观察纤维化程度,vWF染色观察血管新生情况。结果急性心肌梗死伴有2型糖尿病患者外周血循环EPCs动员时间高峰较急性心肌梗死非糖尿病患者延迟(DM vs. NDM:第7天vs.第5天)且高峰点EPCs数量显著减少(DM vs. NDM:285±56/106MNCs vs.431±88/106MNCs,p<0.05)。糖尿病组血浆VEGF、SDF-1α以及hsCRP在高峰点的水平显著高于非糖尿病组(DM vs. NDM VEGF:285±26pg/ml vs.201±25pg/ml,p<0.05; SDF-1α:3533±269pg/ml vs.2807±265pg/ml, p<0.05; hs-CRP:72±46mg/1vs.59±30mg/1, p<0.05)。所有病人平均随访2.25年,糖尿病心梗患者表现为左室射血分数下降(DM vs. NDM:46.83%±6.64%vs.52.38%±5.42%,pp<0.05)。在临床事件主要终点中,糖尿病心梗患者心血管死亡率增加(DM vs. NDM:25.81%vs.6.45%,p<0.05)。次要终点中,糖尿病心梗患者复合心血管事件(包括心血管死亡、卒中、再发心梗)增加(DM vs. NDM:45.16%vs.16.12%,p<0.05),再发胸痛(DM vs. NDM:80.65%vs.32.25%,p<0.05)、支架数量(DM vs. NDM:2.21±0.63vs.1.75±0.68,p<0.05)、NYHA评分(I)M vs. NDM:2.23±0.82vs.1.53±0.64,p<0.05)增加。其他观察终点包括卒中、再发心梗、缺血再入院、择期PCI或CABG手术率、冠脉血栓发生率两组间没有差异。动物实验中,急性心梗伴糖尿病大鼠外周血EPCs动员高峰较急性心梗非糖尿病大鼠延迟(DM vs.NDM：第3天vs.第1天)且高峰点EPCs数量显著减少(DM vs. NDM:101±44/105MNCs vs.260±64/105MNCs, p<0.05).糖尿病急性心梗大鼠骨髓p-Akt/Akt (p<0.05)、p-eNOS/eNOS (p<0.05)以及MMP-9(p<0.05)表达下降,MMP-9活性下降(p<0.05),VEGF表达先升高,后下降(p<0.05)。超声心动图显示与非糖尿病心梗大鼠相比,糖尿病心梗大鼠心梗后四周左室射血分数(DM vs. NDM:54.25%±1.58%vs.59.72%±1.89%,p<0.05)与短轴收缩率下降(%FS DM vs. NDM:26.41%±2.31%vs.29.47%±0.89%,p<0.05),左室舒张末直径(p<0.05)和左室收缩末直径(p<0.05)增加,组织学观察显示糖尿病心梗大鼠心肌纤维化增加(p<0.05),血管新生减少(p<0.05)结论糖尿病人急性心肌梗死后EPCs动员能力较非糖尿病病人差,随访2.25年后临床心血管事件增加；同时糖尿病大鼠急性心肌梗死后内皮祖细胞动员障碍,心功能下降,血管新生减少,心室重构增加,这可能与骨髓p-Akt/p-eNOS/MMP-9通路受损相关。骨髓EPCs动员障碍可能是糖尿病病人心肌缺血后血管新生障碍及预后较差的重要原因。