TFPR1是竹叶青（Trimeresurus flavoviridis）蛇毒CRISPs家族蛋白Triflin的N端PR-1结构域，由163个氨基酸残基组成。我们在以前的研究中，采用原核表达系统成功表达了该PR-1结构域，并命名为TFPR1蛋白;而且我们发现TFPR1蛋白对蛋白类抗原具有免疫佐剂活性，可能是一种新型蛋白佐剂。本研究主要针对TFPR1蛋白对不同类型的小分子多肽抗原的免疫增效作用及机制进行深入研究。同时，针对原核系统表达的重组TFPR1蛋白存在复性困难和活性低的问题，探索采用酵母表达系统进行重组表达。　　1.表达TFPR1的基因工程菌及重组TFPR1蛋白的稳定性分析　　(1) pET-TFPR1质粒的稳定性及表达TFPR1的稳定性分析:对保存2年的甘油菌质粒进行双酶切及测序鉴定目的基因无突变，证明长期保存的表达TFPR1的基因工程菌具备良好的稳定性;对重组蛋白TFPR1的诱导表达、纯化及复性条件进行分析，结果表明TFPR1的表达具备稳定性。　　(2)不同条件下贮存的重组蛋白TFPR1稳定性分析:在无防腐剂和稳定剂条件下，同一批次溶于PBS的重组蛋白TFPR1溶液分别保存在室温和-20℃，在不同时间（3、12和18个月）时，采用Bradford法检测蛋白浓度。结果证明重组蛋白TFPR1的保存具备较好的稳定性，适于长期保存。　　2.重组蛋白TFPR1对不同特性多肽类抗原的免疫增效作用分析　　(1)重组蛋白TFPR1能够增强不同特性多肽抗原的免疫原性，但作用强度有所不同:将重组蛋白TFPR1与三种不同特性的多肽(HIV-1 CBD、HIV-1 MPER、HIV-1 Env197-232)分别进行混合，无需偶联，于末次免疫后14天采血，检测血清抗体滴度及抗体亚类。结果表明重组蛋白TFPR1能够显著增强三种不同特性的多肽(HIV-1 CBD、HIV-1 MPER、HIV-1 Env197-232)的免疫原性，并且能够诱导引起Th1型偏倚的Th1/Th2型免疫应答反应，且高于铝佐剂，TFPR1对HIV-1MPER多肽的免疫增强作用最弱。　　(2)重组蛋白TFPR1的佐剂活性与多肽抗原自身特性有关:通过分析多肽抗原的极性、疏水性和分子量等特性与TFPR1作用强度的关系，初步发现多肽抗原的极性可能是影响TFPR1佐剂活性的主要因素，疏水性和分子量也是较为重要的影响因素。　　3.重组蛋白TFPR1发挥免疫佐剂增效作用的机制研究　　(1)重组蛋白TFPR1在小鼠体内的免疫学活性研究:检测肌肉注射TFPR1小鼠不同时间血清及注射局部肌肉组织中的细胞因子，结果发现TFPR1可激活小鼠免疫系统产生细胞因子IL-6、IL-8、IL-10及IFN-γ。　　(2)重组蛋白TFPR1在小鼠体外激活免疫细胞产生细胞因子:无菌分离小鼠脾细胞，加入重组蛋白TFPR1体外培养24小时后收集上清，ELISA法检测细胞因子。结果表明重组蛋白TFPR1能够在体外激活小鼠免疫细胞产生细胞因子IL-6、IL-10及IFN-γ。　　(3)重组蛋白TFPR1与抗原递呈细胞的结合:采用流式细胞术检测重组蛋白TFPR1与小鼠免疫细胞的结合情况，结果显示重组蛋白TFPR1主要与B细胞、巨噬细胞结合，同时也能够与T细胞及其他细胞少量结合。　　4.重组蛋白TFPR1在毕赤酵母系统中的表达及活性分析　　(1)重组毕赤酵母菌株的构建:克隆构建质粒pPICZαA-TFPR1并酶切及测序鉴定，电转至毕赤酵母系统野生型菌株X33，博来霉素加压挑选阳性克隆。　　(2) TFPR1在毕赤酵母系统中的表达与鉴定:采用ELISA法筛选高表达菌株，采用SDS-PAGE及Western blot确定表达蛋白的分子量及其表达产物的特异性。实验结果表明TFPR1以分泌形式在毕赤酵母系统中成功表达。　　(3)酵母系统表达的重组蛋白TFPR1生物学活性的分析:以小鼠脾细胞为模型，检测表达产物对小鼠免疫细胞的激活作用，结果发现TFPR1能够激活小鼠免疫细胞产生细胞因子IFN-γ及IL-10，初步证实表达产物具备生物学活性。　　(4)酵母系统表达的重组蛋白TFPR1佐剂活性分析:以雌性BALB/c小鼠为研究对象，对酵母系统表达TFPR1的佐剂活性进行初步分析，检测结果发现TFPR1与多肽类抗原HIV CBD简单混合免疫小鼠即能够在短时间内增强多肽抗原HIV CBD的免疫原性，初步证明表达产物具备佐剂活性。　　5.结论　　本研究首先分析了TFPR1重组表达基因工程菌及重组蛋白TFPR1的稳定性特征，实验结果表明原核表达的重组蛋白TFPR1在长期保存中稳定性好。其次，以三种不同特性的多肽抗原为基础，系统进行了重组蛋白TFPR1对小分子多肽抗原免疫增效作用的研究。研究发现，重组TFPR1蛋白对三种不同特性的多肽类抗原均具有免疫增强作用，但对不同极性特征的多肽的免疫增效作用强度不同。实验研究表明重组TFPR1蛋白可能通过结合B细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞，从而激活免疫细胞产生细胞因子而发挥佐剂活性。最后，本研究采用毕赤酵母系统成功获得以可溶性形式表达且具有活性的重组蛋白TFPR1，为深入研究TFPR1蛋白的佐剂功能和进行大量制备奠定了基础。