背景与目的:目前,恶性胶质瘤即使经过手术、放疗、化疗和贝伐单抗靶向治疗等,仍然未能明显提高患者的生存期。对于人们寄于厚望的靶向治疗,Chen Ricky回顾性分析发现“靶向治疗对神经胶质瘤影响不大”并探讨其原因。近年来对胶质瘤分子认识的进展提示靶分子没有找准可能与靶向治疗胶质瘤失败有关。具体来说,胶质瘤由多种不同的分子亚型组成,具有不同的生物学、自然史和预后。世界卫生组织把分子亚型作为胶质瘤的诊断和分类的依据之一,靶分子治疗趋向于个体化。然而,个体化的靶分子筛选必须依赖大数据和高通量分子生物信息学技术引入临床,目前这还处于体外培养细胞和动物体内实验阶段,尚未直接进入临床试验。本文旨在从高通量大数据的Deep Sequencing(RNA seq)数据库中挖掘与胶质瘤恶性进展相关的分子数据,为今后用于靶分子治疗研究打下基础。材料和方法:1、LOXL1在胶质瘤中的表达及生物表征1)通过肿瘤数据库获取数据进行队列研究,确定LOXL1基因表达与胶质瘤的相关性;从病理和临床确诊的神经胶质瘤患者中收集肿瘤组织和瘤旁组织,采用实时荧光定量PCR与免疫印迹技术(Western Blot)检测胶质瘤组织中LOXL1的水平。2)培养NHA、U87-MG和U251等细胞系并检测其LOXL1的水平;构建沉默LOXL1基因表达的sh RNA慢病毒,感染U87-MG和U251细胞并建立稳转细胞系;构建过表达LOXL1的过表达慢病毒感染NHA细胞建立稳转细胞系;采用Western Blot检测所建立稳转细胞系中LOXL1基因的沉默和过表达效果。3)使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、平板克隆形成实验、流式细胞仪及Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及Transwell体外迁移实验检测确定沉默和过表达LOXL1基因对NHA、U87-MG和U251细胞生长速度、克隆形成、细胞周期、细胞凋亡及细胞迁移能力的影响。2、LOXL1在hsa-mi R-125a调控胶质瘤恶性进展中的作用1)胶质瘤中mi RNAs的差异性表达:使用通过Deep Sequencing检测胶质瘤与正常脑组织中差异性表达的mi RNAs。2)研究LOXL1与hsa-mi R-125a的调控关系:使用Target Scan、mi Radna等生物学信息网站预测LOXL1上游可能的mi RNA,接着通过双荧光素酶报告基因检测方法验证确认hsa-mi R-125a对LOXL1 m RNA的3’UTR区的靶向结合作用。3)hsa-mi R-125a的过表达对LOXL1基因表达的影响:使用hsa-mi R-125a mimics转染U87-MG及U251细胞,转染后通过Real-time PCR检测hsa-mi R-125a mimics转染细胞中LOXL1 m RNA的表达水平。其次,运用Western blot检测hsa-mi R-125a mimics转染后细胞LOXL1蛋白的表达水平。从而研究hsa-mi R-125a的过表达对胶质瘤细胞系中LOXL1基因表达的影响。4)hsa-mi R-125a的过表达对胶质瘤细胞功能的影响:运用上述hsa-mi R-125a mimics转染成功的U87-MG及U251细胞,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、平板克隆形成实验、流式细胞仪及Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒检测hsa-mi R-125a的过表达对U87-MG和U251细胞生长速度、克隆形成、细胞周期及细胞凋亡的影响。3、LOXL1在Wnt/β-catenin调控胶质瘤恶性进展中的作用1)权重共表达网络及GO富集分析LOXL1与Wnt/β-catenin信号通路的相关性。2)构建TGF/β-catenin的Luciferase报告基因质粒,并转染沉默LOXL1基因的稳转U87-MG和U251细胞系后检测Luciferase活性。3)构建沉默LOXL1基因表达的sh RNA慢病毒,感染U87-MG和U251细胞并建立稳转细胞系;构建过表达LOXL1的过表达慢病毒感染NHA细胞建立稳转细胞系;Western-blot法检测LOXL1沉默之后的U87-MG和U251细胞核中的β-catenin水平。4)使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒、流式细胞仪、Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒及Transwell体外迁移实验检测β-catenin抑制剂IWR-1-endo对稳定过表达LOXL1基因的NHA细胞增殖、细胞凋亡及细胞迁移能力的影响。结果:1)与瘤旁组织相比,LOXL1在胶质瘤组织中呈高表达(P<0.01);在U87-MG和U251细胞中,LOXL1的基因表达水平显著高于正常胶质瘤细胞系NHA(P<0.01)。2)细胞生物学特征:LOXL1沉默显著降低了U87-MG和U251细胞的生长速度和克隆形成能力,并造成细胞周期在G0/G1阶段被抑制,同时增加U87-MG和U251细胞的凋亡比例并抑制了U87-MG和U251细胞的迁移能力。LOXL1过表达显著提高正常胶质细胞活力和细胞克隆形成能力,并增加了胶质瘤S期细胞的分布。同时减少了NHA细胞的凋亡比例。3)荧光素酶报告实验:显示hsa-mi R-125a和LOXL1-3’UTR-wild质粒共转染能显著抑制荧光素酶活性,表明LOXL1是hsa-mi R-125a的直接靶点。4)hsa-mi R-125a过表达的U87-MG和U251细胞中,LOXL1的基因表达水平下调,hsa-mi R-125a过表达显著降低了U87-MG和U251细胞的生长速度和克隆形成能力,并造成细胞周期在G0/G1阶段被抑制,同时增加U87-MG和U251细胞的凋亡比例。5)在U87-MG和U251细胞中沉默LOXL1基因表达显著降低β-catenin的入核。LOXL1基因的沉默下调明显降低Wnt/β-catenin报告质粒的luciferase活性;β-catenin抑制剂IWR-1-endo明显抑制LOXL1基因过表达对NHA细胞的增殖促进作用,并显著增加NHA细胞的凋亡水平并抑制了NHA细胞的迁移能力。结论:1)本研究报告了LOXL1在胶质瘤组织和体外培养的细胞中都是高表达的,并且用基因过表达和沉默的方法,从正反两方面证实了这个结论是可靠的。2)本研究报告调控胶质瘤恶性进展的LOXL1-hsa-mi R-125a-Wnt/β-catenin通路,为今后靶分子治疗胶质瘤提供了一个新的选择。