论文部分内容阅读
蛋白酶占据世界工业酶市场的60％，广泛应用于医药、食品、化工等领域。目前已报道的微生物蛋白酶有900多种，但仅几十种应用于工业。针对目前工业用蛋白酶种类较少，作用范围较窄，酶制剂品种单一等问题，本研究采集东海水产养殖池塘底泥样品，采用skim milk assay筛选、分离、鉴定，获得了一株蛋白水解酶高活性菌株，命名为Paenibacillus lautus CHN26。 运用基因克隆技术，以Paenibacillus lautus CHN26基因组DNA为模板，克隆鉴定了该菌株三种新型蛋白水解酶基因：ATP依赖型 ClpP蛋白酶、羧基端蛋白酶CtpAp和锌依赖型金属蛋白酶M50p。clpP基因全长为597 bp，编码199 aa，预测分子量大小为21.91 kDa；采用大肠杆菌E.coli BL21表达系统，构建了高表达质粒pET-28-clpP，实现了在E.coli BL21中的异源表达。采用Ni-NTA-His·Bind纯化柱，获得了ClpP纯化蛋白，大小分别为21 kDa和25 kDa，推测clpP基因可能与宿主菌E.coli BL21的clpX基因协同表达，形成了伴侣蛋白。 羧基端蛋白酶基因ctpAp全长为1473 bp，包含72 bp信号肽序列，编码成熟蛋白467个氨基酸，预测分子量大小为51.39 kDa；采用大肠杆菌E.coli BL21表达系统，构建了高表达质粒pET-28-ctpAp，实现了在E.coli BL21中的异源表达，表达的重组蛋白为52 kDa。采用Ni-NTA-His·Bind纯化柱，获得了CtpAp纯化蛋白50.64 mg（每克细胞湿重）。CtpAp酶的最适反应温度是30℃，最适反应pH为9.0。该酶在20-35℃下可保持95.6%酶活力，可是当酶反应温度高于50℃时，CtpAp酶活力迅速下降，表明该酶是一种中温蛋白酶。CtpAp酶的底物特异性研究发现，CtpAp可以水解高等植物 pD1蛋白，C末端24短肽，其断裂位点为Ala-Ala。CtpAp能够在多个位点水解αS1-casein（214 aa，GenBank:1308122A）和β-casein（224 aa，Swiss-Prot:P02666.2）底物，运用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪（matrix assisted laser desorption ionization/time of flight MS, MALDI-TOF-MS）技术分析发现，CtpAp水解αS1-casein底物C末端的Asn205-Ser2，Ser206-Glu207和Glu207-Lys208，CtpAp还能够水解αS1-casein底物位于多肽链中部的肽键，断裂位点为 Leu35-Leu36，Phe38-Phe39，Asn53-Glu54，Ser130-Ala131和Ala131-Glu132。CtpAp还水解β-casein底物 C末端的Glu210-Pro211, Leu213-Gly214, Gly214-Pro215和Pro215-Val216肽键，β-casein中部的Ala15-Arg16，Gln69-Thr70，Val107-Met108，Gln175-Ser176，Gln175-Ser176和Gln182-Ser183位点。上述结果证明了CtpAp是一种内肽酶。进一步分析发现，CtpAp是一种非金属离子依赖型蛋白酶，常规蛋白酶抑制剂PMSF(10 mM)和DFP(5 mM)对CtpAp酶活性无抑制作用。可是，0.5%（w/v）表面活性剂SDS,Tween-80,Tween-20和DTT和1%（v/v）有机试剂（甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇、丙酮、正己烷、DMSO）强烈抑制该酶活性。 m50p基因全长为693bp，编码230个氨基酸；采用大肠杆菌E.coli BL21表达系统和枯草杆菌 Bacillus subtilis1A751表达系统，构建了高表达质粒pET-28-M50p和pDGREF-M50p，实现了m50p基因在大肠杆菌和枯草杆菌中的异源表达，其表达的蛋白分别为26.64 kDa和29 kDa。采用Ni-NTA-His·Bind纯化柱，分别获得了两种表达系统表达的M50p纯化蛋白，在大肠杆菌表达系统可获得纯化M50p蛋白42 mg/g细胞湿重，M50p占细胞裂解上清总蛋白的5.16%；枯草杆菌表达中M50p可分泌到上清液中，每毫升细胞培养液可获得75 mg纯化蛋白，M50p占培养液上清总蛋白的16%。M50p酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH为8.0。M50p酶的底物特异性研究发现，M50p可从N端或C端水解αS1-casein底物。运用MALDI-TOF-MS技术分析发现，其水解αS1-casein断裂位点为Ala15-Arg16, Gln24-Gly25, Gln28-Glu29, Gly25-Leu26, Phe38-Phe39和Asn199-Pro200。另外，M50p可从 C末端或肽链中部水解β-casein，其断裂位点为 Gly214-Pro215, Leu213-Gly214, Leu140-Thr141, Leu207-Tyr208, Leu206-Leu207, Phe205-Leu206, Ser183-Lys184, Thr143-Asp144和Tyr208-Gln209，表明M50p是一种内切蛋白酶。采用HPLC技术分析发现，M50p可以水解三种二肽，即Leu-Cys, Cys-Cys和Ala-Cys。进一步研究发现，蛋白酶M50p是一种锌离子依赖型蛋白酶，0.5%（w/v）表面活性剂SDS，Tween-80，Tween-20，o-phen和1%（v/v）有机试剂（同上）强烈抑制该酶活性。此外，在枯草杆菌中表达的M50p，对温度、pH、金属离子、变性剂和抑制剂处理的耐受性均高于大肠表达的M50p。 综上所述，本文分离鉴定获得的蛋白水解酶高活性 Paenibacillus lautus CHN26菌株的M50p和CtpAp是两种酶学特性完全不同的蛋白水解酶。