研究背景及目的恶性肿瘤因其始终不能根治的特性而成为严重威胁人类健康的疾病之一。肿瘤侵袭转移被认为是导致患者死亡的最重要因素。因此,深入阐明肿瘤侵袭转移的分子机制是提高患者生存的关键。研究发现,肿瘤细胞由原来的上皮细胞转化为具有移行能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力,即上皮间充质转化(EMT),是恶性肿瘤获得迁移和侵袭能力的前提。因此,深入阐明肿瘤细胞EMT及侵袭转移的发生及分子机制是延长患者生存期的关键。本课题拟从肿瘤细胞自身变化,及肿瘤微环境中的外界因素引起EMT及侵袭转移,分两部分深入阐明肿瘤细胞EMT及侵袭转移的的发生及分子机制。一、肿瘤细胞自身改变:通过上调miR-214表达,实现EMT及侵袭转移。既然研究报道,肿瘤细胞发生EMT及侵袭转移是由细胞内一系列基因表达改变决定的,包括蛋白分子,miRNAs等。研究者发现miRNA可以通过自身的上调和下调分别行使原癌基因和抑癌基因的作用,在不同层面起到控制EMT过程的刹车开关作用。研究报道,miR-214在肺腺癌细胞的表达与差的预后显著相关,但miR-214在肺腺癌中的具体作用及其机制鲜有报道。尤其在肺腺癌EMT及侵袭转移中的作用未见报道。结合我们前期研究发现miR-214在肺腺癌细胞EMT过程中表达显著上调,那么,miR-214是否正是肺腺癌细胞实现EMT及侵袭转移的关键分子呢?因此,本课题第一部分内容,将探讨肿瘤细胞通过自身上调miRNAs分子表达,进而诱使EMT及侵袭转移的发生及机制。二、从肿瘤微环境的角度出发:CSCs以旁分泌的方式诱使肿瘤细胞的基因变化,实现其EMT及侵袭转移的发生。长期以来,肿瘤细胞EMT及侵袭转移的发生机制,主要集中在肿瘤细胞通过自身改变某些基因或miRNAs,实现EMT及侵袭转移等生物学特性。近年来研究发现,肿瘤细胞之所以能在特定的器官发育或转移,其赖以生存、相互作用的肿瘤微环境同样起着关键作用。肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞、成纤维细胞、及间充质干细胞等均以旁分泌的方式,在肿瘤细胞侵袭转移中发挥了关键作用。而CSCs被认为是肿瘤细胞中一群具有特殊功能的细胞,以其自身具有的自我更新、EMT状态及高侵袭转移等生物学特性而成为肿瘤复发转移的根源。但CSCs以其他方式参与肿瘤的发生发展未见任何报道。作为肿瘤微环境中的重要组成部分,CSCs紧密结合在肿瘤细胞周围,虽然同上述肿瘤微环境的基质细胞一样,CSCs在实体瘤中所占比例甚少,但在极度恶性或经放化疗处理的肿瘤组织中,CSCs比例可显著增加,甚至高达20%左右。此外,CSCs可通过不定向分化潜能以不对称分裂的方式分化成为肿瘤细胞及CSCs,可见肿瘤细胞与CSCs在空间位置上密不可分。此外,众多研究证实CSCs可分泌大量的在肿瘤复发转移中起关键作用的趋化因子,而肿瘤细胞则表达相应的趋化因子受体。基于此,我们推测CSCs除了以自身的特殊功能而直接参与肿瘤发生发展外,还可能同其他的肿瘤基质细胞一样,通过旁分泌的方式作用于肿瘤细胞,以另一种全新的方式介导肿瘤的发生及侵袭转移。因此本课题第二部分内容中,我们在前期成功分离鉴定OCSCs,并系统分析其所分泌的趋化因子基础上,拟从旁分泌的视角完善并补充肿瘤细胞EMT及侵袭转移的发生及分子机制。总之,本课题拟从肿瘤细胞通过自身的改变,及CSCs旁分泌作用两个方面,深入阐明肿瘤细胞EMT及侵袭转移的的发生及分子机制,为临床侵袭转移的防治提供了新的思路。研究方法第一部分:miR-214在肺腺癌EMT及侵袭转移中的作用及机制研究1.miR-214在肺腺癌EMT中的表达:通过real-time PCR法检测缺氧诱导、TGF-β及药物诱导的三种EMT体外诱导模型中miR-214的表达情况;同时检测处于EMT状态及分化过程的CSCs上miR-214的表达;并进一步检测不同侵袭转移能力的肺腺癌细胞上miR-214的表达情况。2.miR-214在肺腺癌EMT及侵袭转移中的作用:通过慢病毒过表达或shRNA干扰miR-214表达后,经real-time PCR、western blot法及免疫荧光法检测miR-214表达变化所引起的EMT相关蛋白的改变情况;同时检测miR-214上调或抑制表达对三种肺腺癌细胞EMT诱导模型的影响。经流式细胞术、real-time PCR法检测miR-214过表达后肺腺癌CSCs的干细胞标志物及比例变化;并经单个细胞成球实验检测miR-214过表达对肺腺癌CSCs干性功能的影响。体外经transwell迁移及基质胶侵袭实验,分析miR-214表达变化对肺腺癌侵袭转移能力的影响。体内经小鼠尾静脉转移瘤模型观察miR-214过表达对肺腺癌细胞转移能力的影响。3.miR-214靶基因sufu的鉴定及功能研究:经在线预测法及荧光素酶报告实验分析miR-214与sufu基因的3’-UTR结合情况;采用real-time PCR、免疫荧光及western blot法检测miR-214与sufu表达相关性。采用慢病毒过表达或抑制sufu表达,经体外transwell迁移及基质胶侵袭法及体内小鼠尾静脉转移瘤模型,观察sufu在肺腺癌细胞EMT及侵袭转移中的作用;并通过过表达miR-214与sufu基因,观察sufu在介导miR-214促进肺腺癌细胞EMT及侵袭转移中的作用。采用免疫荧光法及western blot法观察sufu下游作用分子Gli-1的表达及细胞内的定位情况。4.临床样本验证miR-214-sufu通路与肺腺癌EMT相关性:经real-time PCR法及免疫荧光法观察miR-214及sufu基因在肺腺癌癌旁、癌巢及转移瘤组织中的表达情况,并分析两者相关性。经免疫荧光法观察sufu及miR-214与EMT相关标志物的表达关系。5.Twist介导肺腺癌EMT过程中miR-214的表达:经real-time PCR法及werstern blot法观察twist阻断后,对miR-214及sufu表达的影响;并分析twist与miR-214及sufu表达相关性。第二部分:OCSLCs在NCSLCs的EMT及侵袭转移中的作用及机制研究1.OCSLCs对NCSLCs的EMT及侵袭转移的影响:采用GFP及RFP分别标记OCSLCs及NCSLCs并置于transwell中,观察在OCSLCs存在时对NCSLCs侵袭转移能力的影响。通过0.4μm的transwell共培养体系及CM处理法,经transwell迁移、基质胶侵袭及细胞划痕法观察两种细胞在仅可溶性因子通透的情况下,OCSLCs对NCSLCs侵袭转移能力的影响。并经腹腔共注射法构建小鼠转移瘤模型,观察OCSCLs存在时对NCSLCs转移能力的影响。采用transwell共培养及CM处理法,经real-time PCR、免疫荧光及western blot法检测OCSCLs存在时对NCSLCs的EMT进程的影响。2.CCL5及其受体介导OCSLCs促进NCSLCs的EMT及侵袭转移:经免疫荧光法检测OCSLCs分泌的CCL5与NCSLCs上CCL5受体的结合情况;在OCSLCs与NCSLCs的共培养体系中,加入CCL5及其受体的中和阻断抗体,并经real-time PCR、免疫荧光、及western blot法观察其对OCSLCs促进NCSLCs EMT的作用;经transwell迁移及基质胶侵袭法,观察其在OCSLCs促进NCSLCs侵袭转移中的作用。通过shRNA法干扰OCSLCs上CCL5分泌,经体内腹腔共注射模型观察对NCSLCs转移能力的影响。3.临床样本验证miR-214-sufu通路与肺腺癌EMT相关性:收集20例配对的卵巢癌病人癌旁组织、癌巢组织及转移瘤组织,经免疫组化法检测CCL5及其受体在三种组织部位的表达情况。4.CCL5及其受体介导OCSLCs促进NCSLCs EMT及侵袭转移的分子机制:采用western blot、免疫荧光及ELISA法检测同OCSLCs共培养或rhCCL5直接处理后,NCSLCs上NF-κB的在细胞浆或核上的定位情况及其活性。同时观察在共培养体系中加入NF-κB阻断剂PDTC后,NCSLCs的侵袭转移情况。研究结果第一部分:miR-214在肺腺癌EMT及侵袭转移中的作用及机制研究1.miR-214在肺腺癌EMT过程中表达上调:miR-214在三种肺腺癌EMT诱导模型中均呈现高表达,且在E-cadherinlow的EMT状态细胞中表达显著增强。miR-214在CSCs上表达明显高于普通肿瘤细胞,且随着CSCs的分化程度增强其表达逐渐减弱;miR-214在不同转移强度的肺腺癌细胞中呈现差异表达,转移强度越高的细胞miR-214表达越强。2.miR-214促进肺腺癌细胞EMT及侵袭转移:miR-214过表达后可显著增强肺腺癌细胞间质标志物,而降低上皮标志物,表现为EMT程度显著增强;miR-214表达受阻后肺腺癌细胞EMT诱导过程受阻。MiR-214过表达后也可显著增强肺腺癌细胞干细胞标志物表达及其比例,同时增强其成球能力。此外,miR-214过表达后可显著增强肺腺癌细胞侵袭转移,及在小鼠体内的转移能力。3.Sufu为miR-214的直接作用靶分子:miR-214可与sufu基因3’-UTR区结合,并直接抑制sufu表达。且在EMT过程中sufu表达显著降低,与miR-214表达呈负相关。Sufu过表达后可显著抑制肺腺癌EMT及侵袭转移能力,sufu表达抑制后可表现为与miR-214类似的生物学效应;sufu过表达可逆反miR-214过表达所增强的肺腺癌细胞EMT及侵袭转移能力。Sufu可显著抑制Gli-1活化及其从胞浆转移至胞核的过程,进而抑制hedgehog信号通路。4.临床样本证实miR-214-sufu通路与肺腺癌EMT相关性:在肺腺癌组织标本中,miR-214与sufu表达呈显著负相关;且在miR-214低表达组织中可见强的E-caherin表达,弱的vimentin表达,而sufu同样呈现低表达,而在miR-214高表达组织中可见相反结果。同时在配对的肺腺癌原发瘤和转移瘤组织中,可见miR-214在转移瘤表达明显高于原发瘤,而sufu则呈现相反结果。5.Twist介导肺腺癌EMT过程中miR-214的上调表达:twsit表达抑制后可见miR-214表达显著降低,而sufu表达则显著增强,且miR-214与twist在肺腺癌组织中表达呈显著正相关。第二部分:OCSLCs在NCSLCs的EMT及侵袭转移中的作用及机制研究1.OCSLCs促进NCSLCs的EMT及侵袭转移:在OCSLCs与NCSLCs直接共培养情况下,NCSLCs的侵袭转移能力可显著增强;且两种细胞不直接接触或CM处理的情况下,OCSLCs同样可增强NCSLCs的侵袭转移能力,说明OCSLCs对NCSLCs的促进作用不依赖于细胞间的直接接触,是由可溶性细胞因子所介导。在小鼠腹腔共注射转移瘤模型中,可见OCSLCs共注射可显著增强NCSLCs的转移能力。在OCSLCs存在时,可显著增强NCSLCs的EMT化,表现为上皮标志物表达下调,间质标志物上调表达。2.CCL5及其受体介导OCSLCs促进NCSLCs的EMT及侵袭转移:OCSLCs分泌的CCL5可与NCSLCs上表达的CCL5受体结合;共培养体系中阻断CCL5及其受体后,可显著抑制OCSLCs对NCSLCs的促进作用;将rhCCL5直接作用于NCSLCs,可诱导其发生EMT,并增强其侵袭转移能力。经shRNA阻断OCSLCs上CCL5的分泌后,可见OCSLCs对NCSLCs侵袭转移能力的增强作用显著抑制。3.临床样本验证CCL5:CCR1/CCR3/CCR5通路与卵巢癌侵袭转移相关性:CCL5及其受体在卵巢癌病人癌旁组织中仅见极弱表达,在卵巢癌癌巢组织中可见一些阳性表达,其表达强度明显高于癌旁,而CCL5及其受体在卵巢癌转移瘤组织中可见明显阳性表达,其表达强度明显高于卵巢癌癌巢组织。4.CCL5及其受体介导OCSLCs促进NCSLCs EMT及侵袭转移的分子机制:在OCSLCs存在时,或rhCCL5直接处理后,NCSLCs上的NF-κB在细胞核中表达明显增多,且活性可显著增强。而在共培养体系或rhCCL5直接处理组中加入NF-κB阻断剂PDTC后,可见OCSLCs或rhCCL5对NCSLCs的侵袭转移能力的增强作用显著抑制。结论:第一部分:miR-214在肺腺癌EMT及侵袭转移中的作用及机制研究从肿瘤细胞自身改变角度:通过上调miR-214表达,直接抑制靶基因sufu,从而充分激活Gli-1介导的hedgehog信号通路,最终诱使肺腺癌细胞发生EMT及侵袭转移。1.肺腺癌细胞发生EMT过程中miR-214表达上调。2.miR-214促进肺腺癌细胞EMT,并增强其侵袭转移能力。3.抑癌基因sufu为miR-214的直接作用靶分子。4.miR-214和sufu在肺腺癌组织表达呈显著负相关,miR-214在肺腺癌转移瘤中表达高于原发瘤组织,而sufu基因则相反。5.miR-214通过抑制sufu表达,从而充分激活Gli介导的Hedgehog信号通路,最终促进肺腺癌细胞EMT及侵袭转移。第二部分:OCSLCs在NCSLCs的EMT及侵袭转移中的作用及机制研究从肿瘤微环境的角度出发:OCSLCs以旁分泌的方式通过CCL5-CCR1/3/5通路,诱使NCSLCs的NF-κB活化,诱导NCSLCs发生EMT及侵袭转移。1.OCSLCs可增强NCSLCs的EMT进程及侵袭转移能力。2.OCSCLs能够分泌大量的CCL5,并与NCSLCs上表达的受体结合。3.OCSLCs通过分泌CCL5与NCSLCs上受体结合,增强EMT及侵袭转移能力。4.CCL5与其受体结合后,通过上调NCSLCs上NF-κB活性,进而介导OCSLCs对NCSLCs的EMT进程及侵袭转移能力的促进作用。