过继细胞免疫治疗(adoptive cell immunotherapy,ACT)是肿瘤免疫治疗非常有潜力的治疗手段。基于CAR修饰的T细胞(chimeric antigen receptor engineered T cell，CAR-T)的ACT是近年来肿瘤免疫治疗的新突破。临床前和临床研究的观察结果显示CAR-T在血液系统恶性肿瘤和部分实体瘤治疗中取得了显著疗效。然而，该治疗策略却存在一些固有的局限性。CAR是由组成型启动子启动表达的，这种类型启动子不受外界影响而持续表达，没有组织和时空特异性。一旦CAR-T输入患者体内，就像被打开的“开关”一直处于“ON”的状态，无法通过外界因素调控CAR-T细胞活性。目前，已提出若干策略来改善CAR-T安全性。其中一个策略是加入诱导型自杀基因开关(iCaspase9)，以消除输注的T细胞。一旦被激活，这种开关可以迅速消除90％以上的iCas9转导的T细胞。其他方法集中于通过“非致命”开关调控T细胞活性，这对于需要长期治疗的患者可能是有益的。　　胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见的恶性脑瘤，也是最致命的癌症之一。根治性手术、放疗和化疗后，患者中位生存期仅为12-15个月，迫切需要探索新的治疗策略。表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)是EGFR最常见的突变形式，仅在肿瘤细胞中表达。此外，EGFRvⅢ与胶质母细胞瘤的血管生成增加和侵袭性密切相关。因此，EGFRvⅢ是肿瘤靶向治疗理想的靶点。近年来，靶向EGFRvⅢ的CAR-T疗法在GBM治疗中备受关注，多项正在研究的免疫疗法与EGFRvⅢ相关，包括肽疫苗，树突细胞疫苗接种疗法，单克隆抗体和CAR修饰的T细胞。包括课题组在内的不断更新的研究观察证明了EGFRvⅢCAR-T疗法的功效，特别是在实现长期肿瘤抑制和降低与GBM相关的死亡率方面。目前，在有限的EGFRvⅢCAR-T治疗GBM的临床试验中，尚未观察到明显的毒副作用，可能与T细胞归巢和增殖的程度较低有关。然而，随着CARs的发展，在有效性提高的同时，由于缺乏调控机制，CAR-T细胞的安全性仍然令人担忧。因此，开发有效且可调控的CAR-T细胞是GBM治疗的新思路。　　目的:　　制备分离式合成受体修饰的T细胞(ssCAR-T)，探索ssCAR-T有效性和可调控性。　　本文主要分为以下几个部分:　　第一部分：稳定表达EGFRvⅢ的人恶性脑胶质瘤细胞U87MG的构建及鉴定　　方法:　　(1)慢病毒介导的U87MG细胞的转染：采用磷酸钙介导的三质粒共转染293T细胞的方法包装慢病毒。计数105个U87MG细胞铺于24孔板，按照MOI=20进行感染。　　(2)嘌呤霉素最低有效浓度分析：设置不同浓度嘌呤霉素，观察72h时细胞状态，能够使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度即为筛选浓度。　　(3)稳定表达EGFRvⅢ细胞株筛选：首先，采用有效浓度的嘌呤霉素初筛，然后经过96孔板稀释法挑选单个细胞，之后进行扩大培养，最终得到稳定表达EGFRvⅢ细胞株。　　(4)稳定表达EGFRvⅢ细胞株的鉴定：流式细胞术，Western Blot，细胞免疫荧光检测EGFRvⅢ的表达。　　结果：(1)嘌呤霉素针对U87MG-EGFRvⅢ的最低有效浓度为2ug/ml。　　(2)流式细胞术结果显示：经嘌呤霉素筛选后，表达EGFRvⅢ的U87MG细胞达到90％以上。　　(3)Western Blot结果显示：EGFRvⅢU87MG组和SMMC7721组细胞在分子量大小约为130KD处出现条带，对照MG63和U87MG组细胞无此条带。各组在分子量大小约为37KD处均有条带，为内参β-actin。该结果验证外源性EGFRvⅢ在U87MG细胞的表达。　　(4)细胞免疫荧光结果显示：与对照组U87MG细胞相比，EGFRvⅢ-U87组细胞几乎均发出绿色荧光。说明外源性EGFRvⅢ已成功表达于U87MG细胞。　　第二部分：靶向EGFRvⅢ的嵌合抗原受体修饰的T细胞(cCAR-T)的制备及功能研究　　方法:　　(1)慢病毒包装：表达传统第二代CAR(cCAR)的质粒前期已构建，采用磷酸钙介导的三质粒共转染293T细胞的方法包装慢病毒。超速离心法浓缩慢病毒。　　(2)cCAR-T细胞的制备：密度梯度离心法分离人外周血淋巴细胞，用抗人CD3/CD28免疫磁珠激活淋巴细胞，然后通过慢病毒介导cCAR的转染。　　(3)采用流式细胞术分析转染效率。　　(4)采用流式细胞术检测扩增后细胞亚型。　　(5)非放射性细胞毒性检测试剂盒检测EGFRvⅢ+CAR-T细胞的杀伤能力。　　(6)通过ELISA法检测EGFRvⅢ+CAR-T细胞因子分泌能力。　　(7)通过裸鼠异种移植模型检测EGFRvⅢ+CAR-T在体内的抗肿瘤效应：肿瘤体积监测，免疫组化分析。　　(8)采用SPSS17.0统计学软件处理数据，进行统计学分析。　　结果：(1)慢病毒滴度检测试剂盒显示：制备的慢病毒液滴度为(5～10)×106TU/ml。　　(2)流式细胞术检测转染效率结果显示：CAR的转染效率在50％以上，慢病毒成功转染淋巴细胞。　　(3)流式细胞术检测细胞亚型结果显示：细胞扩增后以中枢记忆性T细胞(TCM)为主，表现为CD45RA-CCR7+，其中，早期分化淋巴细胞占(54.3±11.4％)，说明制备的CAR-T细胞具有良好的活性。　　(4)EGFRvⅢ+CAR-T体外细胞毒性检测结果显示：EGFRvⅢ+CAR-T能够特异性识别EGFRvⅢ阳性U87细胞，且随着效靶比的增加，EGFRvⅢ+CAR-T细胞的杀伤能力增加。在效靶比为10∶1时，EGFRvⅢ+CAR-T细胞能够杀死大于50％的靶细胞。但是，与EGFRvⅢ阴性U87共培养时，在相同的效靶比的情况下，各组T细胞间无明显差异。　　(5)EGFRvⅢ+CAR-T体外细胞因子分泌结果显示：当与EGFRvⅢ阳性U87共培养时，EGFRvⅢ+CAR-T组细胞分泌IFN-γ(1972.4±115.4)的水平高于对照NT T组(274.5±47.3)和CD19+CAR-T组(217.2±39.0)细胞，差异具有显著统计学意义(P＜0.001)。同样，EGFRvⅢ+CAR-T组细胞分泌TNF-α(847.6±108.3)的水平高于对照NT T组(80.2±21.4)和CD19+CAR-T组(100.8±18.6)细胞，差异具有显著统计学意义(P＜0.001)。与EGFRvⅢ阴性U87共培养时，各组T细胞间细胞因子IFN-γ、TNF-α分泌无明显差异。　　(6)肿瘤生长曲线结果显示：肿瘤体积从注射EGFRvⅢ+CAR-T细胞3周开始缩小，而对照组(PBS组、NT T细胞组)肿瘤继续快速生长，差异具有统计学意义(P＜0.01)。　　(7)移植瘤免疫组化结果显示：与对照组(PBS组、NTT细胞组)相比，输注EGFRvⅢ+CAR-T细胞的裸鼠的移植瘤中，EGFRvⅢ阳性的U87细胞明显减少。　　第三部分：靶向EGFRvⅢ的分离式受体修饰的T细胞(ssCAR-T)的制备及可调控性研究　　方法:　　(1)分离式合成受体(ssCAR)结构设计：将传统第二代CAR(cCAR)的胞内共刺激分子结构域和CD3ξ结构域拆分为两个独立的结构域，这两个部分通过引入化学诱导的二聚化(CID)结构重组。只有在化学分子(AP21967)存在的情况下，ssCAR-T才能形成完整结构而被激活。为了使重新组合的ssCAR能够达到与cCAR-T相当的抗肿瘤功能，设计了2种含有不同数量共刺激分子的分离式合成受体结构(结构Ⅰ+Ⅱa和Ⅰ+Ⅱb)，流式细胞术检测不同条件下T细胞活化分子CD69的表达，以选择更优的ssCAR结构。　　(2)表达ssCAR的Jurkat细胞的制备：ssCAR慢病毒转染Jurkat细胞，流式细胞术和Western blot验证ssCAR表达。　　(3)基于ssCAR+Jurkat细胞优化实验条件：通过ELISA法检测在不同剂量AP21967的情况下，ssCAR+Jurkat分泌细胞因子IL-2的量。流式细胞仪检测在500nM AP21967作用1，3，5，12和24h时，ssCAR+Jurkat T细胞表达CD69的变化。　　(4)表达ssCAR的原代淋巴细胞(ssCAR-T)的制备及验证：慢病毒转染T淋巴细胞，流式细胞术检测CAR的表达效率。　　(5)ELISA法检测不同剂量小分子对ssCAR-T细胞因子IFN-γ和TNF-α分泌的影响。　　(6)非放射性细胞毒性检测试剂盒分析不同剂量小分子对ssCAR-T细胞杀伤功能的影响　　(7)流式细胞术分析小分子不同作用时间对ssCAR-T细胞效应功能的影响。　　(8)采用SPSS17.0统计学软件处理数据，进行统计学分析。　　结果：(1)流式细胞术检测结果显示：与Ⅰ+Ⅱa结构CD69的表达量(31.6±5.1)％相比，结构Ⅰ+Ⅱb转染的细胞在相同条件下对抗原和小分子的响应更强，CD69的表达为(72.2±4.8)％，差异具有统计学意义(P＜0.01)，而结构Ⅰ+Ⅱb转染的细胞CD69的表达与cCAR-T(78.2+5.6)％相比，差异无统计学意义(P＞0.05)。此外，在没有小分子的情况下，只有表达传统二代CAR(cCAR)结构的细胞被激活。(2)流式细胞术检测结果显示：ssCAR转导Jurkat细胞的效率为85.2％。　　(3)Western blot结果显示：在相应泳道中，检测到分子量大约38kD(ssCAR的PartⅡ)和54kD(ssCAR的PartⅠ)处有条带，而在未转染T细胞中未观察到，表明ssCAR已成功转导Jurkat细胞。　　(4)ELISA法检测在给与不同剂量AP21967的情况下，ssCAR+Jurkat分泌细胞因子IL-2的量，结果显示：细胞因子IL-2的分泌随小分子剂量增加而增加，当AP21967浓度为500nM时，Jurkat T细胞产生强烈的IL-2分泌。　　(5)流式细胞术分析ssCAR+Jurkat对小分子剂量的反应，结果显示：随小分子作用时间延长，活化细胞增多，用AP21967处理5h时，引起CD69的表达显著增加(63.4％)，而活化T细胞的百分比在12h时和24h分别为66.3％和69.5％。此外，在仅有靶抗原(EGFRvⅢ)或仅有小分子刺激的情况下，ssCAR-T细胞不能被激活。　　(6)流式细胞术检测结果显示：ssCAR转导T淋巴细胞的效率超过50％。　　(7)ELISA法检测结果显示：随着AP21967浓度的增加，IFN-γ和TNF-α的释放同步增加。在500nMAP21967作用下，ssCAR-T细胞释放细胞因子的水平与cCAR-T细胞相似。　　(8)ssCAR-T细胞毒性检测结果显示：ssCAR-T杀死靶细胞的能力与AP21967的浓度正相关。与较低剂量(10nM)AP21967处理的细胞相比，用较高剂量(100nM)处理的ssCAR-T细胞具有显著增加的细胞毒性。在500nM AP21967作用下，ssCAR-T细胞毒性与cCAR-T细胞相当。作为对照，无论是未转导的T细胞还是cCAR-T细胞，当与EGFRvⅢ阴性U87细胞共培养时，均未检测到肿瘤细胞杀伤的增加。　　(9)流式细胞术检测小分子给药持续时间对ssCAR-T细胞毒性结果显示：小分子处理3h诱导超过35％的靶细胞凋亡，而在5h时为66％。而在没有AP21967处理的情况下，仅有12.5％的EGFRvⅢ+U87细胞凋亡。　　结论：(1)ssCAR-T能特异和有效识别EGFRvⅢ阳性U87细胞，表现为肿瘤抗原和小分子双依赖。　　(2)不同剂量和作用时间的小分子能调节ssCAR-T抗肿瘤活性。　　(3)在足量(500nM)小分子作用下，ssCAR-T可达到与cCAR-T相当的抗肿瘤功能。