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背景变形链球菌(Streptococcus.mutans,SM)是一种含细胞壁多糖的革兰阳性兼性厌氧细菌,属于链球菌属。SM是龋齿的主要致病菌。该细菌主要通过合成SAⅠ/Ⅱ(表面抗原蛋白)粘附分子形成生物膜而附着在牙齿表面。其在富含碳水化合物的环境下产酸,长期的酸性环境会造成牙齿脱矿、牙釉质破坏,最终导致龋齿发生。龋齿是一种不可逆的牙齿损伤。在我国,5岁以下儿童中龋齿发病率高达70%,成人中龋齿发病率高达80%。因此,预防口腔牙齿感染SM对降低龋齿发病率非常重要。被动免疫疗法是给予特异性免疫球蛋白(IgG),通过抗体对病原体的中和作用,促使机体免疫细胞对病原体清除,进而达到疾病的预防与治疗。文献报道,给予动物口腔抗SM抗体,可显著降低SM对口腔牙齿感染和龋齿发病率。目前,具有功能活性的抗SM抗体主要靶点是SM表面蛋白SAⅠ/Ⅱ和葡糖基转移酶(GTF)。有结果表明,针对SAⅠ/Ⅱ蛋白的抗体已用于动物模型和志愿者的龋病预防中。有多种载体已用于抗SAⅠ/Ⅱ抗体的表达,如甘蔗、烟叶、酵母表达的鼠源IgG1、乳酸杆菌表面表达的抗SAⅠ/Ⅱ单链抗体等。但是,这些方式表达的抗体都因各种因素限制它们的临床应用和普及,如鼠源IgG1的大分子量、工业生产的质量控制、其本身的免疫原性,乳酸杆菌介导的单链抗体亲和力和本身携带的抗生素抗性基因等。单链抗体(Single chain antibody,ScFv)是由一条短肽将抗体的轻链可变区和重链可变区相连所构成。因其分子量小,基因结构简单易操作和可在中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)细胞表达等特点,已被广泛用于疾病诊断和治疗中。我们前期制备的由乳酸杆菌表面表达的抗SAⅠ/Ⅱ ScFv,可明显降低由SM引起的大鼠龋齿发病率,但其表达载体上的抗性基因限制其在临床应用。在本课题中,我们构建噬菌体ScFv突变文库,借助CHO-K1细胞表达ScFv-Fc重组抗体,并鉴定其与SM-SAⅠ/Ⅱ蛋白的生物学活性。噬菌体展示技术(Phagedisplaytechnology,PDT)作为一项分子水平技术,是将抗体或多肽蛋白表达展示在噬菌体表面的同时,其相对应的基因序列会在其核酸中出现。该技术已广泛用于新型抗体鉴定和抗体工程化生产。CHO细胞是一种独特的金标准细胞系,已用于工业上表达和生产重组蛋白和抗体。通过CHO表达的许多治疗性抗体已被临床应用,如阿瓦斯汀、抗PD-1抗体等。还有通过在CHO细胞中表达ScFv融合蛋白来用于病原菌治疗,如ScFv-Fc治疗HBV等。在本课题中,我们通过利用CHO-K1细胞来表达特异性识别SM-SAⅠ/Ⅱ蛋白的ScFv-Fc重组抗体。目的应用计算机辅助分子模拟和分子克隆技术、噬菌体单链抗体(ScFv)展示技术、CHO真核表达技术,筛选高亲和、特异识别SM-SAⅠ/Ⅱ蛋白的ScFv-Fc重组抗体。方法(1)以鼠源抗SM ScFv序列为模板,利用计算机辅助分子模拟预测氨基酸关键位点。通过Overlap PCR扩增ScFv突变抗体序列,将突变体ScFv克隆至噬菌体展示质粒,构建噬菌体展示文库。(2)运用PDT对噬菌体突变ScFv库进行四轮“吸附-洗脱-扩增”体外生物淘选,筛选出特异性针对SAⅠ/Ⅱ蛋白的噬菌体阳性克隆,并通过菌液PCR来验证非特异性结合的噬菌体克隆。通过Phage-ELISA检测噬菌体阳性克隆,测序并经多组序列分析后,挑取具有代表性的克隆进行亚克隆。(3)构建PHB-ScFv-Fc重组质粒,瞬时转染至293T细胞株中,Wesstern blot实验检测ScFv-Fc重组质粒在细胞培养上清液中的表达。(4)将重组质粒ScFv-Fc转染至CHO-K1工程细胞株中,ELISA检测细胞培养上清与SAⅠ/Ⅱ蛋白的亲和活性。(5)将亲和活性高的CHO-K1细胞株扩大培养,收集细胞培养上清,利用HiTrap Protein AHP亲和层析柱上机纯化,得到高纯度、高浓度的ScFv-Fc重组抗体。(6)ELISA鉴定纯化后的3种ScFv-Fc重组抗体与SAⅠ/Ⅱ蛋白的结合活性。(7)Western blot和免疫荧光,测定3种ScFv-Fc重组抗体与SM-SAⅠ/Ⅱ蛋白的结合。(8)通过非竞争ELISA试验检测3种ScFv-Fc重组抗体与SAⅠ/Ⅱ蛋白的亲和力。(9)细菌凝集试验检测3种ScFv-Fc重组抗体对SM的凝集作用。(10)应用体外生物膜形成试验,测定3种ScFv-Fc重组抗体对SM生物膜形成的影响。结果(1)利用计算机模拟和基因突变工程技术,成功构建库容为106噬菌体突变ScFv库。(2)利用PDT筛选出192个噬菌体阳性克隆,菌液PCR鉴定出72个阳性克隆。从中随机挑取53个克隆做Phage-ELISA,选取OD值大于3.0的送测序,有36个克隆序列正确,多组序列比对后,从中挑取8个具有代表性的克隆,亚克隆至PHB-Fc载体中。(3)将8个PHB-ScFv-Fc重组质粒,转染293T和CHO-K1细胞,表达纯化出3种(45、56、172)ScFv-Fc重组抗体,并且,均与SAⅠ/Ⅱ有强的结合活性。(4)Western blot和免疫荧光结果显示,3种ScFv-Fc重组抗体均可与SM-SAⅠ/Ⅱ蛋白特异性结合。(5)非竞争ELISA结果显示,3种ScFv-Fc重组抗体(45、56、172)与SAⅠ/Ⅱ蛋白的亲和力比ScFv-Fc-WT增加两倍。(6)凝集试验证明3种ScFv-Fc重组抗体可中和SM发生凝集反应。(7)3种ScFv-Fc重组抗体对SM体外生物膜形成有弱抑制作用。结论(1)计算机辅助分子模拟和分子克隆技术、噬菌体突变ScFv展示技术、CHO真核表达技术,可成功提高ScFv-Fc与SM-SAⅠ/Ⅱ蛋白的亲和力,比原ScFv-Fc-WT亲和力提升两倍。(2)拿到3株表达高亲和活性ScFv-Fc重组抗体的CHO-K1细胞株。(3)高亲和ScFv-Fc重组抗体可特异性结合SM,并对其体外生物膜形成有一定抑制作用。