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目的:1.Micro RNA-21(miR-21)在多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞中的表达水平。2.检测酪氨酸蛋白激酶(Bruton’s tyrosine kinase,BTK)抑制剂ibrutinib对miR-21表达水平的影响及其可能的机制,为ibrutinib应用于MM的治疗提供一定的实验基础。方法:1.MM细胞中miR-21的表达水平:通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)的方法分别检测正常骨髓浆细胞,不同病人的骨髓MM细胞以及MM细胞系中miR-21的表达水平;通过对4例MM患者临床资料的随访,检测其不同疾病阶段骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells,BMMNC)中miR-21的表达水平与MM的肿瘤负荷是否相关。2.miR-21在MM细胞增殖中的作用:MM细胞系LP-1、U266分别转染miR-21mimics和miR-21 inhibitors 24h,MTT比色法检测其细胞活力。3.Ibrutinib对MM细胞活性的影响:MTT比色法检测原代MM细胞和LP-1、U266细胞系加入ibrutinib 24h 后的细胞活力。软琼脂集落形成检测ibrutinib(0μmol/L,10μmol/L)对LP-1、U266细胞系集落形成能力的检测。4.Ibrutinib对MM细胞中miR-21表达水平的影响及可能机制:通过qRT-PCR方法分别检测原代MM细胞和LP-1、U266细胞系加入ibrutinib(0μmol/L,10μmol/L)24 h后miR-21的表达水平;通过westernblotting的方法检测不同药物浓度/不同时间点时,ibrutinib对LP-1、U266细胞系中NF-κB、STAT3蛋白磷酸化水平的影响;并且为了更一步说明ibrutinib可以抑制NF-κB、STAT3的活性,加入NF-κB/STAT3的抑制剂后通过qRT-PCR检测miR-21的表达水平。将ibrutinib和NF-κB、STAT3激动剂联合,采用qRT-PCR检测miR-21的表达水平。为了进一步验证ibrutinib是否通过调节NF-κB、STAT3影响miR-21的表达水平,我们采用免疫荧光染色和染色质免疫共沉淀(Chromatin immune coprecipitation,Ch IP)后PCR来检测药物作用后两者入核量的改变及其与miR-21转录起始部位的结合情况。5.所有实验数据均采用SPSS17.0统计学软件、Graph Pad Prism 5进行数据分析,采用Graph Pad Prism 5作图,Photoshop对Western Blotting、免疫荧光染色的图进行整理、分析,P<0.05为差异具有统计学意义。结果:1.qRT-PCR结果显示:miR-21在MM患者BMMNCs中表达水平明显高于正常对照组,为正常组的21.1倍;当MM患者治疗有效后,miR-21的表达水平出现了降低,仅正常组的5.9倍;复发/难治组MM患者miR-21表达水平明显高于初治组MM患者,为正常组的29.9倍,差异有统计学意义(P<0.01)。Mi R-21表达水平与患者β2-微球蛋白、骨髓瘤细胞比例有相关性,相关系数分别为:0.833和0.758。(n=3,与对照组相比P值均小于0.05)。2.转染miR-21 mimics和miR-21 inhibitors后行MTT比色法得出:miR-21过表达可以促进MM细胞系的生长。(n=3,与对照组相比P值均小于0.05)。3.通过MTT、Western Blotting、qRT-PCR得出:在ibrutinib引起的MM细胞的改变中,首先,MM细胞的增殖能力出现降低,并且ibrutinib对LP-1、U266细胞系的生长抑制率以剂量依赖性方式增加,其对LP-1、U266细胞系的半数抑制浓度(IC50)分别为4.2μmol/L和5.4μmol/L,因此后续的实验主要以0μmol/L,10μmol/L进行;Ibrutinib(10μmol/L)作用后MM细胞中miR-21表达水平降低(原代细胞较对照组降低37.3%,LP-1 miR-21的表达水平较对照组降低33.5%,而U266较对照组降低50.0%)。(n=3,与对照组相比P值均小于0.05)。4.Ibrutinib和NF-κB抑制剂BAY-11或STAT3抑制剂S31-201或Stattic联合作用后miR-21的表达水平均较ibrutinib单用组和抑制剂(BAY-11,S31-201/Static)单用组低。随着ibrutinib作用时间的延长及药物浓度的增加,p-IκBα,p-p65蛋白表达逐渐降低,而p100,p52,IκBα,p65未见明显变化。P-STAT3(Tyr/Ser)均随着药物浓度的增加及作用时间的延长而降低,STAT3无明显变化。相反,将ibrutinib与NF-κB激动剂TNF-α或STAT3激动剂IL-6联合应用后,LP-1、U266细胞系miR-21的表达水平均较ibrutinib单用组升高,但较TNF-α或IL-6单用组低。(n=3,与对照组相比P值均小于0.05)。5.应用ibrutinib组较空白对照组,在U266细胞系中,p-p65、p-STAT3入核量均减少,U266较LP-1明显。Ch IP-PCR的结果显示ibrutinib作用MM细胞4 h后,p-p65,p-STAT3与miR-21的转录起始部位的结合均减弱,U266较LP-1明显。(n=3,与对照组相比P值均小于0.05)。结论:Ibrutinib可以通过降低磷酸化NF-κB和磷酸化STAT3的活性,减少其与miR-21转录起始部位的结合,进而降低miR-21的表达,抑制MM细胞的增殖。