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结核病是由结核分枝杆菌引起的一种慢性传染病，据世界卫生组织(WHO)统计，当前全球约有1／3的人感染了结核杆菌，每年死于结核病的人数达到300万。我国结核杆菌感染率为44.5％，活动性肺结核患者451万，每年死亡人数达13万。结核病成了危害人类健康的重要传染病之一。对结核分枝杆菌的研究再度成为了全球研究的热点。要控制结核病的流行与蔓延的关键在于找到简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法。1998年结核分枝杆菌基因组破译成功，运用基因组杂交技术对结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)的基因组序列进行比较，发现卡介苗(BCG)相比于结核分枝杆菌，有16个基因差异的区域(Region of Difference，RD)，包括RD1-16，其中的RD1区是仅存在于致病性分枝杆菌包括人型结核杆菌、牛型结核杆菌、非洲分枝杆菌及某些非典型分枝杆菌，而不存在于卡介苗(BCG)及其它非致病性分枝杆菌中。RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。CFP10、ESAT6和PPE68的编码基因均存在于RD1区，且具有强烈的免疫原性，因此可将ESAT6、CFP10和PPE68作为诊断结核杆菌感染的特异性试剂。由于单一蛋白在诊断上灵敏度不理想，目前有很多学者认为两个或多个特异性蛋白的联合，有利于提高检测的灵敏度。本研究构建了原核重组质粒pGcfp10、pGesat6、pGcfp10-esat6以及pGesat6-ppe68，经IPTG诱导后在大肠杆菌中高效表达，通过纯化试剂盒获得纯化的重组蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6和ESAT6-PPE68，将三种纯化蛋白免疫动物，获得了高效价的多克隆抗体血清。以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为参考，在建立PPD-ELISA的基础上，建立了以ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法，旨在为临床结核病的诊断提供敏感性、特异性和实用性都比较理想的诊断试剂，为我国结核病的防治提供技术支持。为了能进一步诊断病人是否为现症感染，本实验建立了以多克隆抗体作为包被抗体检测结核病人血清中特异性抗原的双抗体夹心ELISA检测方法，为结核病的早确诊、早治疗提供了一种新的技术思路。本研究共分五部分进行：第一部分，以结核分枝杆菌H37Rv国际标准株基因组DNA为模板，采用常规PCR法扩增出303 bp的cfp10基因和288 bp的esat6基因，随后将其分别定向连接入原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10和pGesat6，经IPTG诱导，约36kDa的GST-CFP10和约32kDa的GST-ESAT6融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，并将GST-ESAT6融合蛋白通过谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化。第二部分，用重叠区扩增基因拼接(GeneSOEing)法扩增cfp10-esat6融合基因，并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建原核表达重组质粒pGcfp10-esat6，IPTG诱导表达约42 kDa带GST标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第三部分，采用重叠区扩增基因拼接(GeneSOEing)法实现了结核分枝杆菌esat6及ppe68基因融合，融合基因esat6-ppe68被克隆入原核表达质粒pGEX-4T-1中，构建了原核表达重组质粒pGesat6-ppe68，并使约69 kDa的GST-ESAT6-PPE68融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达，经谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒得到纯化的融合蛋白。第四部分，将构建的原核表达重组质粒pGesat6、pGcfp10-esat6、pGesat6-ppe68分别在大肠杆菌中经IPTG诱导后大量表达带GST标签的融合蛋白，采用谷胱苷肽-S-转移酶融合蛋白纯化试剂盒获得大量高度纯化的融合蛋白，并将部分纯化蛋白免疫动物，制备高效价的多克隆抗体血清。第五部分，以结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)为包被抗原，通过对血清稀释度、封闭液、底物作用时间及阴阳判定方法等方面的摸索，建立了优化后的PPD-ELISA程序，参考此方法，分别建立了以结核分枝杆菌特异性蛋白ESAT6、CFP10-ESAT6、ESAT6-PPE68为包被抗原检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA检测方法。通过与PPD-ELISA进行比较，认为三种特异性抗体ELISA检测方法在对结核病的诊断上显示了更高的特异性，将特异性抗体ELISA检测方法用于复检PPD-ELISA阳性的病人，将有利于提高结核病诊断的准确性。通过比较三种特异性抗体ELISA检测方法的特异性与灵敏度，认为两融合蛋白-ELISA的敏感性高于单一蛋白ESAT6-ELISA，两融合蛋白-ELISAZ间的敏感性无差异，但CFP10-ESAT-ELISA的特异性高于ESAT6-PPE68-ELISA，三种特异性抗体ELISA检测方法以CFP10-ESAT6-ELISA效果最好，PPE68也是很有研究价值的结核特异性诊断抗原。本部分研究还建立了以包被多克隆抗体检测结核特异性抗原的双抗体夹心ELISA方法，经检测发现，三种方法的灵敏度均较低，分别为12％、18％、19％，但特异性很高，接近100％，认为以结核特异性抗体来检测病人血清中的结核特异性抗原的ELISA检测方法是一种诊断病人是否为结核现症感染的可行的新技术方法。综上所述，检测结核特异性抗体的ELISA方法用于结核病的检测具有敏感性较高，特异性强等优点，可望开发成诊断试剂盒，满足目前临床上结核病诊断的需要，为我国结核病的防治提供技术支持；检测结核特异性抗原的ELISA方法能区别现症感染与既往感染，也能用于结核病治疗的疗效考核，具有很高的研发价值。