研究目的骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）是一种累及全关节的退行性疾病,是导致老年人出现关节疼痛症状甚至致残的重要原因,随着老龄化社会的到来,OA的发病率和患病人数逐年增加。OA发病原因复杂,目前为止,仍然缺乏较好的预防和治疗手段,使关节置换术成为晚期OA患者的唯一选择,给家庭和社会带来沉重经济负担。前期研究发现,慢性、低度的滑膜炎症反应是OA重要的病理特征之一,在OA疾病的发生发展过程中发挥重要作用。此外,异常的滑膜巨噬细胞募集和活化是介导滑膜炎症反应及软骨损伤的重要因素。近期本课题组报道成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）在OA疾病过程中对关节软骨发挥着重要的保护作用,但其对巨噬细胞及滑膜炎症的调控作用尚未见报道。本研究旨在揭示单核/巨噬细胞中的FGFR3在小鼠关节炎疾病过程中的作用及其具体机制,为关节炎的治疗新策略提供实验依据。研究方法1.建立FGFR3髓系细胞特异性敲除小鼠将杂合子FGFR3条件性敲除小鼠(FGFR3^flox/+)与髓系细胞特异性表达cre的LysM^cre小鼠杂交,获得同时含有FGFR3^flox/+;LysM^cre的双杂合子小鼠,再将双杂合子小鼠与杂合子FGFR3条件性敲除小鼠(FGFR3^flox/+)交配一次,获得同时含有两个拷贝FGFR3-flox和LysM^cre的纯合子条件性敲除小鼠(FGFR3^flox/flox;LysM^cre,R3cKO)和对照小鼠(FGFR3^flox/flox,Control)。2.小鼠大体观察分别对3月,6月,13月龄的Control和R3cKO小鼠进行大体观察,测量小鼠的体重和体长,大体拍照,查看小鼠的关节活动度及步态情况,视频采集数据。3.小鼠关节影像学检查用美国Faxitron MX-20型X光扫描仪对小鼠的骨关节进行X光拍照,观察小鼠的骨关节破坏情况。采用瑞士Scanco viva 40型μCT扫描仪对小鼠膝关节标本进行计算机断层扫描,扫描参数设置为:电压70kV,电流113mA,扫描厚度15μm。感兴趣区域（ROI）选自关节周边骨赘,包括膝关节钙化的半月板和滑膜,所有扫描均在相同条件下进行。扫描结束后采用系统自带分析软件进行膝关节的3D重建,重建参数设置为0.8/1/220。4.小鼠关节的病理分析小鼠膝关节标本固定完成后,将标本置于15%的EDTA于4℃脱钙1周左右,PBS漂洗过夜,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡浸泡包埋,于Leica石蜡切片机连续切片,切片厚度5μm。按照间隔80μm左右挑选结构完整的关节切片,脱蜡、复水后进行染色,分别进行藏红固绿染色和HE染色,染色完毕后中性树脂封片,在显微镜下观察。关节评分按OARSI推荐的评分标准进行评价。对每个关节的所有藏红固绿染色切片进行评价后得到每张标本的最高评分（maximal score）,选取4个评分最高值相加后得到总评分值（sum score）,进行统计学分析。滑膜炎评分参照文献报道的方法,对滑膜衬里层增厚,滑膜驻守细胞密度和炎性细胞浸润程度进行评价。通过免疫组化染色观察滑膜巨噬细胞聚集情况。5.循环单核细胞示踪血管内注射荧光微球可用于示踪循环单核细胞。给予10月龄的Control小鼠和R3cKO小鼠尾静脉注射荧光微球,3天后取关节,冰冻切片,DAPI染色后共聚焦显微镜下观察荧光微球标记的单核细胞在小鼠滑膜组织的募集。6.RNA测序分析FGFR3缺失巨噬细胞差异表达基因（DEGs）分离小鼠原代巨噬细胞,提取RNA,进行RNA测序分析,对比R3cKO小鼠和Control小鼠巨噬细胞差异表达基因,并进行GO分析和KEGG通路分析,RT-PCR和WB等实验验证差异表达基因CXCR7及其对巨噬细胞的影响。7.FGFR3缺失对巨噬细胞趋化运动的影响通过Transwell实验研究FGFR3缺失对巨噬细胞趋化运动的影响,在CXCL12诱导下,联合或不联合CXCR7抗体、NF-κB抑制剂、HIF-1α抑制剂处理,观察巨噬细胞的趋化运动情况。8.中和抗体对小鼠关节炎的缓解作用分别给予9月龄R3cKO小鼠和Control小鼠关节腔CXCR7抗体注射治疗8周或DMM R3cKO小鼠关节腔CXCR7抗体注射治疗4周,观察小鼠关节炎表型变化。9.FGFR3调节巨噬细胞趋化运动和基因表达的分子机制分析RNA测序差异基因富集到的信号通路,结合NF-κB、HIF-1α抑制实验,Western blot检测FGFR3缺失巨噬细胞中NF-κB通路激活及CXCR7表达情况。研究结果1.3月和6月龄R3cKO小鼠大体无明显异常通过杂交获得了FGFR3髓系细胞特异性敲除小鼠,R3cKO小鼠与对照小鼠相比在3月龄时大体表型相似,体重和体长在两组间也无显著差异。X片显示,6月龄R3cKO小鼠的骨骼和对照小鼠相比未见显著异常。2.13月龄R3cKO小鼠出现显著关节畸形和步态异常大体观察可见,13月龄的R3cKO小鼠出现肉眼可见的关节畸形和步态异常,X片及μCT扫描均显示13月龄的R3cKO小鼠出现多滑膜关节骨性关节炎样改变,在肩关节、膝关节、髋关节、踝关节等位置出现了明显的异位成骨,以膝关节表型最为显著。3.R3cKO小鼠出现严重的关节软骨破坏病理染色显示13月龄R3cKO小鼠的膝关节软骨磨损严重,软骨基质丢失,软骨下骨被暴露,同时软骨下骨在异常受力下发生硬化。胫骨平台周边出现大量骨赘形成,滑膜区域明显肿胀,呈现典型的骨性关节炎样病理改变。与此同时,同龄Control小鼠的膝关节未见显著关节软骨破坏以及异位成骨。但3月和6月龄的R3cKO小鼠和Control小鼠关节软骨未见显著差异。此外,在DMM模型中,R3cKO小鼠的软骨破坏较Control小鼠加重。4.R3cKO小鼠出现显著的滑膜炎和巨噬细胞聚集病理分析显示,13月龄R3cKO小鼠的膝关节滑膜组织呈现显著的炎症反应和滑膜巨噬细胞聚集。并且在关节软骨出现明显破坏之前,9月龄的R3cKO小鼠膝关节已经出现了显著的滑膜炎和巨噬细胞聚集。滑膜炎症在3月龄和6月龄的Control和R3cKO小鼠中未见显著差异。通过单核细胞荧光微球示踪显示R3cKO小鼠膝关节滑膜区域募集了大量荧光微球标记的细胞,并且滑膜增殖细胞（Ki67）染色显示,Control和R3cKO小鼠关节滑膜区域增殖细胞未见显著差异。5.巨噬细胞FGFR3缺失导致趋化因子受体CXCR7表达上调巨噬细胞RNA测序发现趋化因子受体相关通路显著改变,并且鉴定了CXCR7在FGFR3缺失的巨噬细胞中高表达,此外小鼠外周血单核细胞中FGFR3表达水平随着年龄增加呈下降趋势而CXCR7表达水平上调,与小鼠年龄相关关节炎的发生发展密切联系。在OA患者外周血单核细胞中,FGFR3表达也下调而CXCR7表达上调。6.CXCR7表达上调促进FGFR3缺失巨噬细胞的趋化运动FGFR3缺失的巨噬细胞在CXCL12诱导下趋化运动显著增强,并且这种增强作用可以被CXCR7中和抗体抑制。7.CXCR7中和抗体缓解R3cKO小鼠关节炎表型给予小鼠关节腔抗体注射治疗可以显著缓解R3cKO小鼠年龄相关的关节炎表型,包括关节软骨破坏及滑膜炎症;也缓解了DMM诱导的R3cKO小鼠滑膜炎症表型和巨噬细胞浸润。8.HIF-1α和NF-κB信号通路激活促进CXCR7高表达和巨噬细胞趋化运动分析RNA测序差异基因显示NF-κB、HIF-1α通路被显著富集,激活NF-κB可以显著上调CXCR7 mRNA和蛋白水平,NF-κB、HIF-1α抑制剂可以显著抑制FGFR3缺失巨噬细胞中NF-κB的激活和CXCR7表达以及增强的巨噬细胞趋化运动。此外放线菌素D可以显著抑制FGFR3缺失增强的CXCR7转录水平。研究结论基于本研究的结果得出以下结论:1.FGFR3髓系细胞特异性敲除小鼠出现了更严重的滑膜关节破坏表型;2.FGFR3髓系细胞特异性敲除小鼠中滑膜巨噬细胞数量显著增加;3.在单核/巨噬细胞中,FGFR3缺失正向调控趋化因子受体CXCR7表达,其机制与HIF-1α和NF-κB活化有关;4.靶向CXCR7可以缓解FGFR3缺失介导的小鼠滑膜关节破坏。