【摘 要】
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目的:糖尿病角膜病变（diabetic keratopathy,DK）是糖尿病患者眼部主要的并发症之一,由于糖尿病发病率逐年升高,DK受到越来越多的关注;研究微小RNA 21（micro RNA-21,miR-21）在糖尿病角膜病变中的作用并初步探索其对角膜上皮细胞和三叉神经节细胞的影响,有望为DK的治疗提供新的思路。方法:利用RT-PCR法比较正常小鼠与糖尿病小鼠角膜上皮和三叉神经节组织中miR
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目的:糖尿病角膜病变（diabetic keratopathy,DK）是糖尿病患者眼部主要的并发症之一,由于糖尿病发病率逐年升高,DK受到越来越多的关注;研究微小RNA 21（micro RNA-21,miR-21）在糖尿病角膜病变中的作用并初步探索其对角膜上皮细胞和三叉神经节细胞的影响,有望为DK的治疗提供新的思路。方法:利用RT-PCR法比较正常小鼠与糖尿病小鼠角膜上皮和三叉神经节组织中miR-21的表达;建立WT与miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮损伤模型,荧光素钠染色观察角膜损伤上皮修复情况,特异性神经染色评价角膜上皮下神经丛再生情况,应用TUNEL荧光染色法检测角膜上皮及三叉神经节组织的凋亡情况;在小鼠角膜上皮干/祖细胞系（TKE2）中过表达miR-21,同时给予高糖处理,采用划痕试验检测细胞迁移能力,Annexin V/7-AAD双荧光染色检测细胞凋亡;在原代三叉神经节细胞中过表达miR-21,应用免疫荧光法观察三叉神经节细胞轴突的生长及分支,TUNEL染色法检测三叉神经节细胞凋亡。利用转录组测序筛选WT与miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮及三叉神经节中差异表达的基因,并利用GO对差异表达的基因进行生物功能富集分析;在糖尿病小鼠的结膜下注射miR-21agomir并构建角膜上皮损伤模型,观察角膜上皮损伤恢复及角膜周围神经再生情况,TUNEL荧光染色法检测角膜上皮及三叉神经节组织的凋亡情况。结果:糖尿病小鼠角膜上皮及三叉神经节中的miR-21表达增高,角膜上皮损伤后再生上皮中miR-21表达明显上调,但糖尿病小鼠角膜上皮中miR-21升高幅度低于正常小鼠;miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮损伤的修复明显慢于WT糖尿病小鼠,角膜神经再生密度小于WT糖尿病小鼠;进一步研究表明,miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮细胞及三叉神经节凋亡较WT糖尿病小鼠增加。高糖条件下过表达miR-21后,TKE2细胞的迁移能力较对照组明显增加,凋亡减少;原代三叉神经节细胞在体外过表达miR-21后其轴突长度较对照组明显增加,凋亡细胞数较对照组减少,通过转录组测序筛选出497个和554个分别在WT和miR-21 KO糖尿病小鼠角膜上皮组织和三叉神经节组织中差异表达的基因,GO分析显示差异表达基因显著富集的信号通路主要涉及细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖与分化、细胞凋亡、以及损伤修复及神经生长等;在糖尿病小鼠结膜下注射miR-21 agomir可以明显加快角膜上皮损伤愈合的过程和促进角膜神经再生。结论:1.角膜上皮损伤导致角膜上皮组织中miR-21的表达增高,但糖尿病小鼠角膜上皮组织中miR-21的升高幅度低于正常小鼠;2.Mi R-21促进角膜上皮细胞迁移、降低高糖诱导的角膜上皮细胞和三叉神经节细胞的凋亡程度以及促进神经生长;3.过表达miR-21可促进糖尿病小鼠角膜上皮损伤修复和角膜周围神经的再生。
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