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目的：以γ-谷维素（Oryzanol，ORY）作为干预手段，探讨其在小鼠肝缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion，I/R)损伤中的保护作用及相关分子机制。
方法：以下将分为两部分来阐述本实验的研究方法，分为体内实验和体外实验两部分构成。第一部分为体内实验：（1）首先选取50只C57雄性8周龄小鼠随机分为5组：①假手术组（Sham组）、②缺血再灌注组（I/R组）、③低浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY10组）、④中浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY20组）、⑤高浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY40组），其中②-⑤组进行小鼠肝脏部分I/R手术，③-⑤组进行ORY预处理。（2）小鼠经肝部分缺血再灌注后取血清和肝脏以备后续实验，采取转氨酶检测试剂盒检测各分组血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）含量；（3）对各分组肝脏标本进行H&E（Hematoxylin and eosin，苏木精&伊红）染色；（4）通过试剂盒检测各分组小鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）、还原性谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量；（5）采用Tunel染色法检测各分组小鼠肝脏组织中细胞凋亡情况，评估小鼠肝脏组织损伤程度；（6）使用免疫组化法测定小鼠肝组织中GRP78的表达水平，并采用蛋白免疫印迹法检测肝组织中NLRP3炎症通路相关蛋白、损伤相关分子HMGB1、GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）的表达。
本实验第二部分为体外实验：在体外以CoCl2模拟缺氧环境来诱导小鼠肝细胞系AML12细胞缺氧损伤，探讨ORY对CoCl2诱导的缺氧损伤的影响。（1）首先采用CCK-8法检测不同浓度的γ-谷维素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响、不同浓度的二氯化钴（CoCl2）在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响及在CoCl2诱导缺氧条件下，各浓度γ-谷维素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的作用；（2）设计分组：①空白对照组、②ORY组、③CoCl2组和ORY+CoCl2组（经ORY预处理后CoCl2诱导损伤的AML12细胞组）；（3）通过DCFH-DA染色检测各组肝细胞模型中的活性氧含量；（4）通过Hoechst染色检测各组肝细胞模型中的细胞凋亡情况；（5）采用免疫印迹法检测各组细胞模型中GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）的表达。
结果：第一部分体内实验结果显示：（1）成功建立小鼠肝I/R损伤模型；（2）各浓度γ-谷维素预处理组血清AST、ALT较I/R组明显降低；（3）各浓度γ-谷维素预处理组中肝组织结构的病理损伤变化明显轻于I/R组；（4）γ-谷维素预处理组中肝组织的SOD和GSH含量较I/R组明显增高，而MDA和MOP含量较I/R组明显降低；（5）Tunel染色结果显示各浓度γ-谷维素预处理组肝脏组织中细胞凋亡明显少于I/R组；（6）与I/R组相比，各浓度γ-谷维素预处理组的免疫组化检测小鼠肝组织中GRP78的表达明显下降；（7）与I/R组相比，Sham组和各γ-谷维素预处理组中肝组织的NLRP3炎症通路相关蛋白和损伤相关分子HMGB1表达明显下降；（8）与I/R组相比，Sham组和各γ-谷维素预处理组中肝组织的GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白的表达水平明显降低。（9）与I/R组相比，Sham组和γ-谷维素预处理组中肝组织的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显上调，促凋亡蛋白Bax表达显著下调。第二部分体外实验结果发现：（1）不同浓度的γ-谷维素溶液处理AML12小鼠肝细胞24小时后，400μg/ml浓度范围内的γ-谷维素溶液对小鼠肝细胞的增殖无明显影响；（2）不同浓度的二氯化钴溶液处理AML12小鼠肝细胞24小时后，随着二氯化钴溶液浓度升高，小鼠肝细胞的细胞活力值逐渐下降，当二氯化钴溶液浓度为300μmol/L时，细胞活力值下降为57.80%±3.45，后续建立缺氧模型选取此浓度；（3）不同浓度γ-谷维素溶液对小鼠肝AML12细胞预处理，在300μmol/L二氯化钴溶液条件下培养24小时后，与对照组相比，γ-谷维素溶液浓度在160μg/ml及240μg/ml时细胞活力值明显升高；（4）预处理组(ORY240+CoCl2300组)中肝细胞的活性氧含量明显高于二氯化钴处理组（CoCl2300组）；（5）与二氯化钴处理组（CoCl2300组）相比，预处理组(ORY240+CoCl2300组)中凋亡细胞明显减少；（6）ORY240+CoCl2300组中GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白的表达水平明显降低。（7）与二氯化钴处理组相比，肝细胞的促凋亡蛋白Bcl-2表达水平较二氯化钴处理组明显增高，凋亡蛋白Bax表达水平较二氯化钴处理组明显降低；
结论：γ-谷维素预处理能够改善肝I/R导致的肝脏损伤，其可能的机制与ORY减轻氧化应激、抑制NLRP3炎症通路和降低损伤相关分子HMGB1的表达来减轻炎症反应，并抑制GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路的激活减轻细胞凋亡来实现的。本研究探索了ORY在肝I/R损伤中的保护作用，为ORY将来用于治疗肝脏疾病提供依据。
方法：以下将分为两部分来阐述本实验的研究方法，分为体内实验和体外实验两部分构成。第一部分为体内实验：（1）首先选取50只C57雄性8周龄小鼠随机分为5组：①假手术组（Sham组）、②缺血再灌注组（I/R组）、③低浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY10组）、④中浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY20组）、⑤高浓度γ-谷维素预处理组（I/R+ORY40组），其中②-⑤组进行小鼠肝脏部分I/R手术，③-⑤组进行ORY预处理。（2）小鼠经肝部分缺血再灌注后取血清和肝脏以备后续实验，采取转氨酶检测试剂盒检测各分组血清中谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）含量；（3）对各分组肝脏标本进行H&E（Hematoxylin and eosin，苏木精&伊红）染色；（4）通过试剂盒检测各分组小鼠肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）、髓过氧化物酶（MPO）、还原性谷胱甘肽（GSH）和脂质过氧化产物丙二醛（MDA）的含量；（5）采用Tunel染色法检测各分组小鼠肝脏组织中细胞凋亡情况，评估小鼠肝脏组织损伤程度；（6）使用免疫组化法测定小鼠肝组织中GRP78的表达水平，并采用蛋白免疫印迹法检测肝组织中NLRP3炎症通路相关蛋白、损伤相关分子HMGB1、GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）的表达。
本实验第二部分为体外实验：在体外以CoCl2模拟缺氧环境来诱导小鼠肝细胞系AML12细胞缺氧损伤，探讨ORY对CoCl2诱导的缺氧损伤的影响。（1）首先采用CCK-8法检测不同浓度的γ-谷维素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响、不同浓度的二氯化钴（CoCl2）在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的影响及在CoCl2诱导缺氧条件下，各浓度γ-谷维素在体外对AML12小鼠肝细胞增殖的作用；（2）设计分组：①空白对照组、②ORY组、③CoCl2组和ORY+CoCl2组（经ORY预处理后CoCl2诱导损伤的AML12细胞组）；（3）通过DCFH-DA染色检测各组肝细胞模型中的活性氧含量；（4）通过Hoechst染色检测各组肝细胞模型中的细胞凋亡情况；（5）采用免疫印迹法检测各组细胞模型中GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白和凋亡相关蛋白（Bcl-2和Bax）的表达。
结果：第一部分体内实验结果显示：（1）成功建立小鼠肝I/R损伤模型；（2）各浓度γ-谷维素预处理组血清AST、ALT较I/R组明显降低；（3）各浓度γ-谷维素预处理组中肝组织结构的病理损伤变化明显轻于I/R组；（4）γ-谷维素预处理组中肝组织的SOD和GSH含量较I/R组明显增高，而MDA和MOP含量较I/R组明显降低；（5）Tunel染色结果显示各浓度γ-谷维素预处理组肝脏组织中细胞凋亡明显少于I/R组；（6）与I/R组相比，各浓度γ-谷维素预处理组的免疫组化检测小鼠肝组织中GRP78的表达明显下降；（7）与I/R组相比，Sham组和各γ-谷维素预处理组中肝组织的NLRP3炎症通路相关蛋白和损伤相关分子HMGB1表达明显下降；（8）与I/R组相比，Sham组和各γ-谷维素预处理组中肝组织的GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白的表达水平明显降低。（9）与I/R组相比，Sham组和γ-谷维素预处理组中肝组织的抗凋亡蛋白Bcl-2的表达明显上调，促凋亡蛋白Bax表达显著下调。第二部分体外实验结果发现：（1）不同浓度的γ-谷维素溶液处理AML12小鼠肝细胞24小时后，400μg/ml浓度范围内的γ-谷维素溶液对小鼠肝细胞的增殖无明显影响；（2）不同浓度的二氯化钴溶液处理AML12小鼠肝细胞24小时后，随着二氯化钴溶液浓度升高，小鼠肝细胞的细胞活力值逐渐下降，当二氯化钴溶液浓度为300μmol/L时，细胞活力值下降为57.80%±3.45，后续建立缺氧模型选取此浓度；（3）不同浓度γ-谷维素溶液对小鼠肝AML12细胞预处理，在300μmol/L二氯化钴溶液条件下培养24小时后，与对照组相比，γ-谷维素溶液浓度在160μg/ml及240μg/ml时细胞活力值明显升高；（4）预处理组(ORY240+CoCl2300组)中肝细胞的活性氧含量明显高于二氯化钴处理组（CoCl2300组）；（5）与二氯化钴处理组（CoCl2300组）相比，预处理组(ORY240+CoCl2300组)中凋亡细胞明显减少；（6）ORY240+CoCl2300组中GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路蛋白的表达水平明显降低。（7）与二氯化钴处理组相比，肝细胞的促凋亡蛋白Bcl-2表达水平较二氯化钴处理组明显增高，凋亡蛋白Bax表达水平较二氯化钴处理组明显降低；
结论：γ-谷维素预处理能够改善肝I/R导致的肝脏损伤，其可能的机制与ORY减轻氧化应激、抑制NLRP3炎症通路和降低损伤相关分子HMGB1的表达来减轻炎症反应，并抑制GRP78/PERK/EIF2S1/CHOP内质网应激通路的激活减轻细胞凋亡来实现的。本研究探索了ORY在肝I/R损伤中的保护作用，为ORY将来用于治疗肝脏疾病提供依据。