研究背景和目的：糖尿病是严重危害人类健康的常见病；肝脏、脂肪及肌肉组织对胰岛素的抵抗和胰岛β细胞功能障碍是2型糖尿病两大主要的病理基础。大量的研究表明，2型糖尿病动物的胰岛β细胞、肝脏及脂肪组织细胞都伴有较高的内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERstress)，提示内质网应激与2型糖尿病的发生发展密切相关。 内质网是重要的细胞器之一，也是细胞中蛋白质合成及折叠的重要场所。内质网的主要功能是通过糖基化及形成二硫键来折叠、装配新合成的蛋白质，使之具有一定的立体构型，对蛋白质进行转录后修饰；此外，内质网还在维持细胞内钙稳态中起重要作用。内质网功能正常是维持细胞存活所必须的；凡引起内质网功能紊乱，导致未折叠和错折叠蛋白堆积在内质网内的各种状况统称之为内质网应激。当未折叠或错折叠蛋白在内质网内堆积时，首先，诱导内质网分子伴侣免疫球蛋白结合蛋白/葡萄糖调节蛋白78(immunoglobulin bmding protein/glucose-regulated protein 78，Bip/GRP78)合成增加，从而增强内质网蛋白质折叠能力，以减少蛋白质在内质网的堆积；其次，通过抑制蛋白质的翻译，减少内质网的加工负荷，以减少蛋白质的进一步堆积；随后，当内质网折叠能力不能满足继续增多的未折叠蛋白时，通过活化I型跨膜蛋白激酶/核糖核酸内切酶(type Itransmembrane protein kinase/endoribonuclease，IRE1)，剪接X盒结合蛋白1(X box-binding protein-1，XBP-1)mRNA，并翻译成有活性的XBP-1蛋白，后者可以诱导内质网甘露糖甙酶-I样蛋白表达，促进内质网相关性降解增加；最后，如以上过程仍不能维持蛋白质合成与折叠的平衡时，通过上调CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(C/EBP homology protein。CHOP)表达，诱导内质网介导的细胞凋亡部分细胞凋亡，以保证其它细胞的正常功能。氧化应激和钙离子稳态改变是引起内质网应激的两大主要原因。活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)可以氧化内质网膜上钙离子摄取通道肌内质网Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmic reticulumCa2+-ATPase，SERCA)，导致内质网钙离子浓度下降，从而影响钙依赖的分子伴侣活性；另一方面，一些蛋白折叠酶活性的维持需要游离的巯基，而活性氧簇可以直接攻击这一基团，从而抑制蛋白的正确折叠，加剧内质网应激。抗氧化剂或自由基清除剂能够通过抑制真核翻译起始因子-2α(eukaryotic translation initiation factor 2-alpha，elF-2α)磷酸化、Bip生成增多、CHOP表达上调以及caspase-12活化等机制防止内质网应激。 我室和国内外研究表明，内源性一氧化氮合酶(nitric oxide synthaseNOS)抑制物——非对称性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)升高在胰岛素抵抗、糖尿病以及糖尿病血管并发症中起重要作用。内源性ADMA可抑制NOS活性，不仅减少一氧化氮(nitric oxide.NO)生成；还可使NOS解偶联，促进超氧化物生成。基于ADMA能使NOS解偶联，促进超氧化物生成；活性氧与内质网应激的密切关系以及内质网应激和ADMA在糖尿病中的重要作用，我们推测ADMA可能通过抑制NOS活性，增加氧自由基生成，诱导内质网应激。由于肝脏在调节血糖浓度以及胰岛素抵抗和2型糖尿病发生发展中起重要作用，因此，本课题以2型糖尿病大鼠肝脏和培养的大鼠肝细胞系(H4IIE)作为实验模型，探讨ADMA在2型糖尿病大鼠肝脏内质网应激中的作用；为阐明2型糖尿病的发病机制提供新的实验证据，为2型糖尿病临床防治开拓新思路。 方法：①动物实验：先用高脂饲养4周，然后腹腔注射小剂量链脲佐菌素(35 mg/kg)，再继续高脂饲养8周，制备2型糖尿病大鼠模型；以口服糖耐量试验来评价胰岛素敏感性；并检测血糖、血浆胰岛素、糖化血红蛋白及血脂水平等指标来反映代谢控制；用高效液相色谱法检测血清ADMA浓度；用逆转录．聚合酶链反应(RT-PCR)测定肝脏Bip、CHOP基因的tuRNA水平及用PCR方法检测XBP-1 mRNA的剪接，以此反映肝脏内质网应激情况；用RT-PCR测定肝脏DDAH1和DDAH2基因mRNA水平；用硫代巴比妥酸法测定大鼠肝脏丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量及用黄嘌呤氧化酶法检测肝脏超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性以反映氧化应激；用比色法测定肝脏DDAH及NOS活性，用硝酸还原酶法检测大鼠肝脏NO含量。②细胞实验：采用外源性ADMA(30 gmol/L，)孵育大鼠肝细胞系H4IlE细胞48小时后，观察ADMA对内质网应激的影响；此外，还检测细胞NOS活性、NO含量；MDA水平以及SOD活性；以探讨ADMA引起内质网应激的可能机制。 结果：一、动物实验结果发现：①与正常对照组大鼠比较，糖尿病漠型组大鼠口服糖耐量和胰岛素敏感性指数降低，并出现明显的血糖和血脂代谢紊乱(all P<0.05)，提示2型糖尿病大鼠模型制备成功；②虽然盱脏DDAH1和DDAH2的转录在正常对照组大鼠和2型糖尿病大鼠之间无显著区别(P=NS)，但2型糖尿病大鼠肝脏DDAH活性比正常对照组大鼠显著降低，血清内源性ADMA水平升高，肝脏NOS活性也明显抑制，NO代谢产物Nitrite/Nitrate水平降低(all P<0.05)，反映NO生成减少；③2型糖尿病大鼠肝脏组织分子伴侣Bip和凋亡相关的CHOP基因mRNA水平以及XBP-1 mRNA剪接均比正常对照组大鼠增加(allP<0.05)，提示2型糖尿病大鼠肝脏内质网应激增加；④经直线相关分析发现，2型糖尿病大鼠血清内源性ADMA水平与评价肝脏内质网应激的三个指标包括Bip和CHOP mRNA水平及XBP-1的剪接均呈正相关(allP<0.05)，提示2型糖尿病大鼠血清中内源性NOS抑制物ADMA浓度升高与肝脏内质网应激有关；⑤2型糖尿病大鼠肝脏脂质过氧化产物MDA的含量明显高于正常对照组(P<0.05)，而抗氧化酶SOD的活性则显著低于对照组(P<0.05)，提示2型糖尿病大鼠肝脏氧化应激增加。二、细胞实验：为了进一步探讨2型糖尿病大鼠血清内源性NOS抑制物ADMA升高与肝脏内质网应激的因果关系，我们在培养的大鼠肝细胞株(h4iIE)研究ADMA对肝细胞内质网应激的直接作用。分别用10、30和100 lamol/L ADMA孵育大鼠肝细胞株H4IIE细胞48 h，用RT-PCR检测Bip mRNA水平，结果显示30 gmol/L ADMA诱导肝细胞Bip转录作用最明显；故选用30 μmol/L ADMA分别孵育肝细胞24 h、48 h、72 h和96 h，用RT-PCR检测Bip mRNA水平，结果显示用30 μmol/L ADMA诱导肝细胞24 h～48 h均明显上调Bip的转录，而用ADMA孵育72 h～96 h，肝细胞中Bip的转录有所下降；因此，在后续的细胞实验中均采用30μmol/L ADMA孵育H4IIE细胞48 h。细胞实验结果显示，ADMA明显升高肝细胞中Bip和CHOP mRNA水平，增加XBP-1 mRNA的剪接，表明ADMA可直接诱导肝细胞内质网应激，也提示2型糖尿病大鼠内源性ADMA升高可能是导致肝脏内质网应激的原因，而不是伴随现象；ADMA也明显抑制肝细胞NOS活性，减少NO生成。用外源性NOS抑制物L-NAME(30 μmmol/L)孵育大鼠肝细胞48 h，也具有ADMA相似的作用，提示ADMA的上述作用是通过抑制NOS、减少NO生成所介导的。此外，30 μmol/L ADMA孵育48 h诱导肝细胞内质网应激的作用与阳性对照组用活性氧0.5 mM H2O2孵育1 h诱导肝细胞内质网应激的作用相当；而且ADMA还增加肝细胞中脂质过氧化产物MDA的含量，降低抗氧化酶SOD的活性；更重要的是，用抗氧化剂PDTC(10 μmol/L)预处理肝细胞2 h再与H2O2、ADMA或L-NAME孵育相应的时间均可逆转它们所诱导的肝细胞氧化应激及内质网应激。这些结果强烈表明，ADMA诱导肝细胞内质网应激是由于增加氧化应激所致。 结论：本研究结果表明：①用高脂饲养4周，加小剂量链脲佐菌素(35 mg/kg)腹腔注射，再继续高脂饲养8周，可诱导2型糖尿病大鼠模型形成；②2型糖尿病大鼠血清内源性NOS抑制物ADMA水平明显升高，肝脏内质网应激增加，并且两者密切相关；③内源性ADMA升高可能是2型糖尿病大鼠肝脏内质网应激的重要原因；④ADMA诱导肝细胞内质网应激可能与抑制NOS，减少NO生成，增加氧化应激有关。