鸭CYP7α1基因克隆及表达的研究

来源 :江西农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:MKLIN
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脂肪沉积是受微效多基因调控的数量性状。鸭脂肪过多沉积会导致饲料转化率降低及胴体品质下降,一定程度上制约养鸭业的发展。同时人体摄入过多脂肪,易导致各种疾病的发生。胆固醇7α羟化酶(Cholesterol7alpha-hydroxylase, CYP7al)属细胞色素P450酶类功能性基因,大量研究证实,CYP7α1为脂类代谢机制的重要候选基因,而鸭CYP7α1表达调控仍尚未见有报道。本研究以樱桃谷鸭为试验对象,采用同源克隆及RACE技术成功获得CYP7α1基因全长cDNA,通过基因工程方法构建了原核表达载体,并探讨微生态制剂对该基因mRNA表达水平的影响。1鸭CYP7α1基因的克隆、表达及序列分析利用同源克隆及RACE技术,首次获得鸭CYP7α1基因全长cDNA序列,包括5’-UTR序列78bp、CDS全序列1539bp和3’-UTR序列666bp,编码512个氨基酸。利用在线软件对不同物种间CYP7al基因CDS区序列进行同源性比对、系统进化树构建、生物信息学以及RT-PCR分析。结果表明:鸭CYP7α1基因的CDS序列与鹅的同源性最高,其次是鸡,而与人、大鼠、小鼠、猪、牛的同源性不高。经预测鸭CYP7α1蛋白可能含有一个P450超家族结构域。RT-PCR结果显示:鸭CYP7α1基因在肝脏中呈高丰度表达,在其他9个组织中均未检测到或检测到少量表达,表明该基因的表达具有组织特异性,为进一步研究CYP7α1基因结构和功能奠定基础。2鸭CYP7α1基因原核表达载体的构建通过基因工程的方法构建pET32α-CYP7α1重组表达载体,在工程菌Rossetta-gami(DE3)中进行诱导表达,并对诱导表达条件给予优化。研究结果表明:鸭CYP7α1蛋白在37℃,0.6mmol/L IPTG浓度条件下诱导4小时,在DE3菌中表达量最高,为进一步研究该蛋白在脂类代谢中的作用提供技术手段。3鸭CYP7al基因mRNA水平调控的初步研究采用单因子完全随机设计,将300只1日龄樱桃谷鸭随机分为2个处理组(对照组Ⅰ,实验组Ⅱ),每组设3个重复,每个重复50只鸭,实验组在基础日粮添加1000mg·kg-1微生态制剂。研究结果表明:樱桃谷鸭实验组肝脏中脂代谢关键酶CYP7al基因mRNA的表达量极显著高于对照组(P<0.01),结合前期屠宰及血液生化指标实验,表明该基因的高表达在减少肉鸭脂肪沉积中起着重要作用,为进一步研究该基因在脂代谢中受营养调控的机制提供分子基础。
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