目的：　　 肺癌是全球范围内因癌症死亡的首要原因,我国每年大约有60万人死于肺癌,其中非小细胞肺癌(non-smallcelllungcarcinoma,NSCLC)约占肺癌总数的80%～85%。肿瘤发生是涉及原癌基因和抑癌基因参与的多基因、多步骤过程,是细胞增殖和细胞凋亡失衡的结果。肺癌的发生、发展受到细胞内多条信号转导通路的调节。近年来的研究发现,在肺肿瘤中磷脂酰肌醇-3一激酶(Phosphotylinosital3kinaSe,PI3K)/Akt和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)/ERK信号转导通路活性异常增高,一旦阻断这些信号转导通路,则可以引起细胞周期阻滞,诱导肿瘤细胞的凋亡,进而抑制肿瘤细胞的生长。　　 FOXO1转录因子属于Fox(Forkheadbox)家族成员,近年来被认为是一类极其重要的蛋白家族,可以调控许多基因的表达,参与细胞的分化、氧化应激的抵抗、DNA的损伤修复、细胞周期停滞以及细胞凋亡。FOXO1转录因子作为一个抑癌基因的表达产物,其活性受到多层次的调节,其中磷酸化修饰可减弱其DNA结合能力,抑制其转录活性。在许多癌症中PI3K/Akt和MAPK/ERK通路异常激活,通过磷酸化修饰导致FOXO1蛋白的转录活性受到抑制。MAPK通路和PI3K通路是调节细胞增殖的两条重要的信号转导通路,由于这两条信号通路对细胞增殖都具有正性的调节作用,因而人们认为它们之间存在着一定程度的交互作用,值得强调的是,FOXO1蛋白恰巧处于两条信号转导通路的汇聚点。研究表明,在胰岛β细胞中,低血清的环境下PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路能够共同抑制FOXO1的转录活性,导致细胞的异常增殖。但在非小细胞肺癌中,PI3K/Akt和MAPK/ERK两条信号转导通路对FOXO1因子转录活性调节及其机制尚不清楚。本实验选取肺正常细胞HBE及非小细胞肺癌细胞系A549作为研究对象,选用PI3K特异性抑制剂LY294002和ERK通路特异性抑制剂UO126处理细胞,观察A549细胞中PI3K/AktMAPK/ERK信号转导通路对FOXO1蛋白以及对FOXO1下游靶基因Bim、p27Kipl表达的影响,进而加深PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路在肿瘤细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡中分子调控机制的认识。　　 方法：　　 1、细胞培养,LK2、A549细胞在含10%小牛血清的DMEM培养液、HBE和H460细胞在含10%小牛血清的RPMI1640培养液、饱和湿度、37℃、5%CO2孵箱中传代培养。　　 2、细胞分组,将生长至70%汇合度的A549细胞分组,处理组1加入LY294002(浓度25μmol/L),处理组2加入UO126(深度10μmol/L),处理组3同时加入LY294002(浓度25μmol/L)和UO126(浓度10μmol/L),对照组加入等体积的DMSO,作用24小时候收集细胞。　　 3、MTT比色实验检测LY294002(浓度25μmol/L)、UO126(浓度10μmol/L)、LY294002(浓度25μmol/L)和UO126(浓度10μmol/L),对细胞的生长和增殖情况的影响,并绘制生长曲线,筛选药物的最佳作用时间。　　 4、应用流式细胞术(FlowCytoMetry,FCM)检测A549细胞中对照组及各加药处理组细胞周期变化。　　 5、应用RT-PCR法检测A549细胞中对照组及各实验组FOXO1、Bim、p27Kipl基因的表达差异。　　 6、应用Western-blot法检测肺正常细胞与肺癌细胞系中FOXO1、p-FOXO1的蛋白表达,及A549细胞中对照组及各加药处理组FOXO1、p-FOXO1、Bim、p27Kipl蛋白的表达变化。　　 7、应用免疫荧光法检测FOXO1在非小细胞肺癌A549中的细胞定位情况及不同加药组处理后FOXO1亚细胞定位变化。　　 8、Annexin-FITC细胞凋亡检测A549细胞中对照组及各加药处理组细胞凋亡情况。　　 结果：　　 1、MTT法检测细胞增殖变化　　 与对照组相比LY294002和UO126都能明显的抑制A549细胞的增殖,且具有时间依赖性,两种药物联合处理后对细胞的生长抑制作用更加明显,药物作用24小时时,细胞的生长达到最大抑制率。　　 2、流式细胞术检测细胞周期进程　　 FCM结果显示,用LY294002和UO126作用A549细胞24小时后,细胞周期进程大部分被阻滞在G1期,并且两种药物联合时,细胞周期被阻滞在Gl期的数量较单药组增多,而S期明显减少。　　 3、RT-PCR法检测FOXO1、Bim、p27Kipl基因的表达　　 RT-PCR结果显示,在A549细胞中,与对照组相比,各加药处理组FOXO1基因表达水平无明显差异,而Bim、p27Kipl基因表达水平均升高a且联合药物组Bim和p27Kipl基因表达相应增加。　　 4、Westem-blot法检测FOXO1、p-FOXO1、Bim、p27Kopl蛋白的表达　　 Westenlblot结果显示,肺正常细胞与肺癌细胞系中FOXO1的蛋白表达无显著差异,但磷酸化水平与其他几种肺癌细胞系相比较低。A549细胞经抑制剂作用24小时后,与对照组相比FOXO1的蛋白水平未见显著性变化,而FOXO1的磷酸化水平明显下降,Bim、p27Kipl的表达相应增加。且联合用药组p-FOXO1进一步下降,Bim和p27Kipl表达相应增加。两种药物单独及联合作用前后总的FOXO1的表达水平无明显变化。　　 5、免疫荧光法检测FOXO1亚细胞定位　　 免疫荧光结果显示,对照组FOXO1蛋白主要定位于细胞浆,抑制剂LY294002及UO126单独用药组FOXO1部分向细胞核转位,LY294002和UO126联合处理A549细胞时,FOXO1蛋白大部分积聚于胞核。　　 6、Annexin-FITC双染方法检测细胞凋亡　　 LY294002和UO126作用A549细胞24小时后,与对照组相比,细胞凋亡率增加,药物联合作用后,与单独用药组相比,细胞的凋亡率明显高于单独用药组。　　 结论：　　 1、PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路在非小细胞肺癌细胞系A549的细胞增殖中发挥相当关键的调控作用。　　 2、PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路介导的FOXO1磷酸化,促进A549细胞中FOXO1因子核浆穿梭。　　 3、抑制PI3K/Akt和MAPK/ERK信号通路增强A549细胞中FOXO1转录因子的活性,从而对p27Kipl和Bim在转录水平进行调节,促进细胞周期的阻滞,诱导细胞的凋亡。　　 4、PI3K/Akt和MAPK/ERK信号转导通路在A549细胞的促增殖、抗凋亡的调控中存在交互作用。