百菌清是美国钻石制碱公司于1963年开发的一种广谱高效保护性杀菌剂,是目前国内外在农业生产上使用最广泛的一种杀菌剂。百菌清主要应用于防治蔬菜、大田作物、果树、茶树、烟草及高尔夫球场和各种绿化草坪等作物的真菌病害。由于百菌清对植物体具有良好的黏着性和使用的广泛性,因此百菌清及其转化产物在果蔬、土壤及水中均有较大的残留,甚至在北极地区也能检测到。百菌清对人畜低毒,对鱼、贝类等水生生物高毒,美国国家环境保护总署已经把百菌清列为可能使人类致癌的物质之一。4-羟基百菌清是百菌清在土壤与水环境中的主要降解产物。与百菌清相比,4-羟基百菌清的毒性更强,对土壤、淤泥等更具吸附能力,半衰期更长,且具有良好的水溶性,因此4-羟基百菌清对环境和人类健康会造成更为严重的影响。从2009年起,美国环境保护局将百菌清最高残留限量标准从只针对百菌清修改为针对百菌清及其降解产物4-羟基化合物的总含量。目前,我国百菌清的检测方法主要有气相色谱法、高效液相色谱法等仪器分析方法,对于4-羟基百菌清残留检测的研究较少。这些方法均存在样品前处理复杂、耗时、成本高等问题,不适合大量样品的快速检测,因此建立一种操作简便、快速和检测通量大的方法具有重要意义。免疫检测法是目前用于农药残留分析较为常用的快速检测法,其原理是利用酶标记物同抗原或抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合,既保持了酶催化反应的灵敏性,又保持了抗原抗体反应的特异性,因而极大的提高了灵敏度。鉴于百菌清的广泛使用对人类健康和生态环境造成的危害,本文针对百菌清制备了多种半抗原与多克隆抗体,建立了间接竞争ELISA和胶体金层析检测技术,同时本文还研究了百菌清和4-羟基百菌清总残留检测的间接竞争ELISA检测技术,并将以上技术应用到蔬菜中百菌清的残留检测,取得了以下主要结果：1.百菌清人工抗原的制备与鉴定以百菌清为起始反应物,经1-2步化学反应合成了含有不同特异性基团或偶联臂结构的6种百菌清半抗原,分别使用戊二醛法、羰基咪唑法、活化酯法、混合酸酐法与载体蛋白(BSA或OVA)偶联,获得12种人工抗原,利用考马斯亮蓝法估算了人工抗原的偶联比,其范围在2：1-40：1。2.抗百菌清多克隆抗体的制备与纯化以免疫原免疫雄性新西兰大白兔,获得抗血清,经非竞争ELISA检测其效价范围为1.6×103：1-4.0×104：1。抗血清使用DEAE柱层析法和辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化,获得多克隆抗体,非竞争ELISA测定各抗体的亲和常数均在109-1010之间,效价为1.6×103：1-5.0×104：1。3.百菌清间接竞争ELISA方法的建立通过反应条件与检测条件的优化,建立百菌清间接竞争ELISA方法。利用3种质量较好的抗体进行检测,其IC50的范围在2.275ng/mL～8.34ng/mL之间；IC20的范围在0.90ng/mL～3.35ng/mL之间,各种抗体均具有良好的特异性。马铃薯的百菌清标准添加实验结果表明回收率为84.5%～90.1%,相对标准偏差为2.9%～7.4%。同时使用HPLC检测法进行方法验证,二者在准确度、精密度等方面具有良好的一致性。4.百菌清ELISA检测试剂盒的建立利用本研究建立的百菌清间接竞争ELISA试剂盒对不同样本进行检测,其添加回收率为83.60%-106.00%,批内相对标准偏差的变化范围为0.57%～3.26%,批间相对标准偏差的变化范围为3.07%～9.01%。最低检出限为25ng/mL。试剂盒保存稳定性实验说明,在4℃条件保存6个月后B0仍受控,相关系数仍能达到0.99。5.百菌清胶体金免疫层析试纸条的研制本实验采用柠檬三钠法对氯金酸进行还原,经紫外光谱扫描及电镜分析,胶体金颗粒直径约为18nm,且粒径均一。使用纯化好的抗百菌清多克隆抗体对胶体金进行标记,组装免疫层析试纸条。本方法的检测时间约为30min,检出限约为60ng/mL。6.百菌清及其转化产物多残留检测方法建立使用ELISA检测方法对百菌清及其主要转化产物进行多残留分析,其中百菌清ELISA检测的回收率为86.60%-91.60%；4-羟基百菌清的回收率为105.20%-111.20%；百菌清和4-羟基百菌清等量添加的回收率为85.40%-106.80%。同时该方法具有良好的精密度,百菌清检测的相对标准偏差为4.50%～7.60%；4-羟基百菌清的相对标准偏差为4.40%～5.30%；百菌清和4-羟基百菌清等量添加的相对标准偏差为4.90%-6.30%。