膀胱癌是世界上第九大恶性肿瘤,在我国泌尿系统的肿瘤中占第一位,大约每年有356,000例(男性274,000例,女性83,000例)患者发生膀胱癌,2007年统计在中国城市男性膀胱癌年龄标准死亡率为3.54/100,000,女性为1.19/100,000,在农村其比率为1.92/100,000和0.52/100,000。各级别的膀胱癌治疗方式不同,大约70～85%的膀胱癌患者属于浅表型膀胱癌,经诊断后通过经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)治疗。然而,术后膀胱癌复发率很高,需给予患者膀胱灌注药物以预防肿瘤复发。大部分膀胱灌注药物如卡介苗(BCG),表柔比星,吡柔比星等用于术后预防肿瘤的复发。这些药物通常价格昂贵,并且会产生严重的并发症,如尿频,尿急,尿痛,血尿和免疫抑制等,因此需要寻找一种有效但副作用较少的药物。小檗碱是从中草药黄连素中提取的季胺型异喹啉类生物碱,又称为黄连素,是一种传统的中医消炎及抗菌药物,近年来有研究表明其具有明显的抗肿瘤作用,已经在尤文肉瘤,乳腺癌,食管癌和前列腺癌中发现其有抗肿瘤的作用。小檗碱对人体正常细胞没有毒性,但可以有效的杀灭肿瘤细胞。小檗碱能够抑制多种肿瘤细胞的增殖,诱导细胞周期的G1期或G2期的停滞,并诱导肿瘤细胞产生凋亡。小檗碱能诱导含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)依赖性的凋亡和caspase-9依赖性凋亡,因此我们认为小檗碱通过激活caspase-3和caspase-9使裂解后的caspase-3和-9表达增强,进而使凋亡增强。通过MTT实验,细胞周期分析及流式细胞仪检测细胞凋亡实验,来研究小檗碱对膀胱癌细胞株的作用。我们的研究结果表明小檗碱诱导T24细胞凋亡是通过caspase的凋亡通路。膀胱癌T24细胞系中内源性表达H-Ras,跟膀胱癌的分级和分期有关,并发现有大于35%的膀胱癌病人中有表达。H-Ras是膜结合鸟苷三磷酸腺苷和鸟苷二磷酸结合蛋白(G),起到分子开关的作用,将细胞膜表面的信号传递到细胞核内,Ras可以通过升高cyclinD1的水平导致G1期细胞扩增,对细胞自G1期进入S期有促进作用。C-fos是H-Ras的下游效应基因,在众多恶性肿瘤中起作用。因此本课题研究小檗碱对膀胱癌中H-Ras和c-fos表达抑制的研究,来进一步研究小檗碱抑制膀胱癌细胞的生长,促进细胞凋亡的机制。恶性肿瘤细胞的浸润和转移要穿透细胞外基质(ECM)及基底膜(BM),扩散到周围及远处器官,在ECM和BM中含有大量的基质分子如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、多种胶原以及蛋白多糖等,穿越这些屏障需要相关的酶类,乙酰肝素酶(Hpa)就是一种具有这种功能的酶,它可以在特定的部位裂解HSPG和其硫酸乙酰肝素(HS)侧链,促进肿瘤的侵袭和转移,并通过释放和活化肝素结合性生长因子如bFGF和VEGF等诱导肿瘤新生血管形成。有研究表明小檗碱可以抑制多种肿瘤的转移和侵袭,但是小檗碱通过抑制乙酰肝素酶的表达来抑制转移及侵袭的研究尚未报道,因此我们研究小檗碱对膀胱癌中乙酰肝素酶表达的作用,来抑制肿瘤的转移及侵袭。第一部分为了研究小檗碱抑制膀胱癌BIU-87及T24细胞增殖,诱导细胞周期的阻滞,并且诱导细胞凋亡的发生,我们给予浅表型膀胱癌细胞株BIU-87和浸润型膀胱癌细胞株T24不同浓度的小檗碱药物,作用一定时间后,通过四唑盐比色法(MTT)实验检测膀胱癌细胞的存活情况,利用碘化丙啶(PI)染色,流式细胞仪分析膀胱癌细胞BIU-87和T24的细胞周期,利用Annexin Ⅴ-conjugated Alexa Fluor488(Alexa488)和PI进行双染,通过流式细胞仪检测并分析凋亡细胞的比例；提取小檗碱处理后的T24细胞中的mRNA和蛋白,利用RT-PCR及Western Blot实验检测在膀胱癌T24细胞中表达的原癌基因H-Ras和c-fos,并利用Westernblot实验检测凋亡通路中caspase-3和caspase-9的表达。结果如下：1.四唑盐比色法(MTT)实验结果显示,不同浓度小檗碱(0,1,5,10,25,50,75,及100μg/mL)处理膀胱癌细胞株BIU-87和T24细胞,小檗碱能够抑制膀胱癌BIU-87及T24细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。2.利用PCR在不同浓度及不同时间小檗碱抑制T24细胞中来检测H-Ras和c-fos的表达。结果显示,随着小檗碱浓度的增加及处理时间的延长,在T24细胞中H-Ras和c-fos的mRNA的表达有明显的逐渐减低趋势。这些结果表明,小檗碱对H-Ras和c-fos的抑制具有浓度依赖性和时间依赖性。3. Western blot结果显示,通过逐渐增加的浓度及时间小檗碱处理,在T24细胞中H-Ras和c-fos的蛋白的表达有明显的逐渐减低趋势,并具有时间和浓度依赖性。4.流式细胞仪可以分析小檗碱诱导细胞周期阻滞,结果分析表明,小檗碱处理的细胞停滞在G0/G1期,与未处理的细胞相比,随着小檗碱浓度的增加,停滞在G0/G1期的细胞逐渐增多,并且具有浓度依赖性。5.我们通过对膀胱癌细胞进行Alexa Fluor488annexin Ⅴ和PI双染,流式结果显示小檗碱可以诱导膀胱癌细胞株BIU-87和T24细胞的早期和晚期的凋亡,并且有浓度依赖性。6.为了研究含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(caspase-3)和caspase-9是否在细胞凋亡中起作用,我们用10μg/mL和25μg/mL浓度的小檗碱处理T24细胞,并测定caspase-3和caspase-9蛋白水平。Western blot结果表明,procaspase-3在处理前后没有明显区别,但caspase-3和caspase-9在处理后有明显的升高。这些结果表明小檗碱诱导T24细胞凋亡是由激活caspase-3和caspase-9的机制来完成的。以上结果表明小檗碱能够通过抑制原癌基因H-Ras及其下游基因c-fos的表达,阻滞G0/G1细胞周期,诱导caspase-3和caspase-9依赖的细胞凋亡,从而抑制膀胱癌BIU-87和T24细胞的增殖,更有效的杀伤膀胱癌细胞。因此,小檗碱对膀胱癌有抑制生长的作用,将来可作为一种新的膀胱癌的术后用药。第二部分乙酰肝素酶是一种降解细胞外基质和基底膜的酶,与恶性肿瘤的转移与浸润有关系,并且在膀胱癌中高表达,在膀胱癌细胞株T24中有高表达。本实验采用siRNA技术干扰膀胱癌T24细胞内乙酰肝素酶的表达,并对干扰后的膀胱癌细胞进行迁移和侵袭试验。小檗碱对恶性肿瘤的迁移和转移有抑制作用,用不同浓度小檗碱处理膀胱癌T24细胞,采用Transwell小室,进行细胞迁移及侵袭实验。我们假设小檗碱可以抑制与膀胱癌转移有关的乙酰肝素酶的表达,因此利用不同浓度小檗碱采用PCR及Western blot等方法检测其表达水平的变化。具体结果如下：7.PCR结果显示,乙酰肝素酶在T24细胞中高表达,利用乙酰肝素酶的siRNA技术,通过脂质体2000将hpa-siRNA转染入T24细胞中,将T24细胞中肝素酶的基因敲除,发现与阴性对照相比,乙酰肝素酶表达明显降低,表面hpa-siRNA可以下调乙酰肝素酶的活性,使其表达降低。8. Western blot结果显示,乙酰肝素酶的蛋白在膀胱癌T24细胞中高表达,将利用siRNA敲除乙酰肝素酶的T24细胞的蛋白提取,并进行Western blot实验,结果显示,与对照组相比,乙酰肝素酶的蛋白表达明显降低。9.细胞迁移实验的结果表明,乙酰肝素酶的siRNA可以降低膀胱癌T24细胞的迁移能力,与对照组相比较,转染hpa-siRNA的T24细胞,穿过transwell小室的细胞数目明显减少。10.细胞侵袭实验的结果显示,乙酰肝素酶的siRNA可以降低膀胱癌T24细胞的侵袭能力。乙酰肝素酶siRNA处理过的T24细胞,与对照组相比,穿过铺过ECM胶的小室到下层的细胞数目明显减少。11.利用小檗碱处理膀胱癌T24细胞,逐渐增加的小檗碱的浓度,并处理不同时间,提取RNA并进行PCR试验,结果显示在T24细胞中乙酰肝素酶的mRNA的表达有明显的逐渐减低趋势。这些结果表明,小檗碱对乙酰肝素酶的mRNA的表达具有抑制作用,并具有浓度依赖性和时间依赖性。12. Western blot结果显示,利用逐渐增加浓度的小檗碱处理膀胱癌T24细胞,并采取不同时间,在T24细胞中乙酰肝素酶的蛋白的表达有明显的逐渐减低趋势。这些结果表明,小檗碱能够抑制乙酰肝素酶的蛋白的表达,并且具有浓度依赖性和时间依赖性。13.利用不同浓度的小檗碱处理的膀胱癌T24细胞,种植于Transwell小室的上层,进行细胞迁移实验,结果表明,穿过Transewell小室的T24细胞的数目,随小檗碱浓度的增加而逐渐减少,因此可以推断小檗碱可以抑制T24细胞的迁移能力。14. Transwell小室细胞侵袭试验结果显示,不同浓度小檗碱处理的T24细胞,穿过铺过ECM胶的小室下层的细胞随小檗碱浓度的增加而逐渐减少,因此小檗碱可以抑制T24细胞的侵袭能力。以上结果表明,小檗碱能够下调膀胱癌细胞中乙酰肝素酶mRNA和蛋白的表达,减少细胞外基质和基底膜的分解,进而减弱膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力,由此推断小檗碱可以减少膀胱癌的转移及侵袭,减少膀胱癌的复发。因此,小檗碱能够抑制膀胱癌的生长,并通过抑制乙酰肝素酶的表达来减少膀胱癌的转移及复发机会。综上所述,我们的研究表明小檗碱通过抑制原癌基因H-Ras和c-fos mRNA和蛋白的表达,通过诱导G1细胞周期的阻滞,诱导依赖caspase-3和caspase-9通路的凋亡,从而使膀胱癌BIU-87和T24细胞的增殖受到抑制。小檗碱可以抑制膀胱癌中乙酰肝素酶的表达,通过抑制T24细胞的迁移和侵袭,减少肿瘤细胞的转移与复发,因此,小檗碱对膀胱癌有治疗作用,将来可能成为治疗膀胱癌新的术后灌注用药。